Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la virologie aviaire, telles que la façon dont les virus immunosuppresseurs interagissent avec les cellules B. Le principal avantage de cette technique est que les cellules sont plus pertinentes que les lignées cellulaires immortalisées actuellement utilisées en laboratoire. Bien que cette méthode donne un aperçu de la façon dont les cellules de poulet réagissent à l’IBDV, elle peut également être appliquée à ALV et REV.
Cette méthode réduit le nombre d’oiseaux dans notre recherche, et il est bénéfique pour les trois R, qui signifie le remplacement, la réduction et le raffinement de l’utilisation de l’animal dans la recherche. Dans une armoire de sécurité microbiologique, laver le BF en 30 millilitres de PBS froid au moins trois fois. Transférer le tissu lavé dans une boîte de Pétri et ajouter cinq millilitres d’une solution 1X collagène D.
Utilisez des ciseaux stériles ou une lame de scalpel pour couper le BF en morceaux de moins de cinq millimètres de diamètre. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation périodique douce pendant 30 minutes. Après cela, utilisez une pipette pasteur stérile pour aspirer à plusieurs reprises le mélange pour encourager la désintégration du tissu.
Ajouter un autre cinq millilitres de 1X collagène D solution au tissu, et l’incuber à 37 degrés Celsius avec agitation périodique douce pendant encore 30 minutes. Répétez ce processus, en aspirant le mélange, en ajoutant la solution fraîche de collagène D, et en couveant jusqu’à ce que le tissu soit complètement digéré. Notez qu’il y aura de petits granules qui ne se dissoudront pas davantage.
Passez la suspension cellulaire digérée à travers une passoire cellulaire de 100 microns en 20 millilitres de 1X HBBS sans calcium. Centrifugeuse à 400 fois g pendant cinq minutes. Jeter le supernatant, resuspendre la pastille en 10 millilitres de 1X RPMI avec 5%FBS.
Ensuite, superposer 10 millilitres de la suspension cellulaire sur le dessus de cinq millilitres de densité gradient de médias qui contient du polysucrose et du diatrizoate de sodium. Assurez-vous qu’il existe une interface claire entre les deux couches. Centrifugeuse à 900 fois g et quatre degrés Celsius pendant 20 minutes.
Les cellules doivent former une bande à l’interface entre le média cellulaire et les supports de gradient de densité. Ensuite, utilisez une pipette Pasteur stérile pour enlever les cellules et les transférer dans un tube contenant du PBS froid. Lavez les cellules en les centrifugant à 400 fois g pendant cinq minutes, puis en les réutilisant dans du PBS froid.
Répétez ce lavage trois fois. Tout d’abord, centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes. Resuspendez les cellules en 30 millilitres de 1X IMDM complet.
Prenez un aliquot de la suspension cellulaire, et l’ajouter à une solution bleue Trypan. Comptez le nombre de cellules viables qui excluent le bleu Trypan et déterminez le nombre de cellules et la viabilité en pourcentage. Après cela, centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes.
Resuspendre les cellules dans imdm complet complété par une dilution d’un à 20 de poulet CD40 ligand à une densité de 10 millions de cellules par millilitre. Culture des cellules en plaques de 96 ou 24 puits pendant 48 à 72 heures. 48 à 72 heures après l’isolement, décongeler un aliquot du virus.
Vortex l’échantillon, et le stocker sur la glace. Resuspendez les cellules de bourses primaires dans le milieu IMDM. Prenez un aliquot de 10 microlitres de la suspension cellulaire, et ajoutez-le à 10 microlitres d’une solution bleue Trypan.
Ensuite, déterminez le nombre de cellules et la viabilité en pourcentage. Diluer le virus en 1X imdm complet à la multiplicité appropriée de l’infection pour rendre le virus inoculum. Mélanger cette dilution par vortex.
Centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supernatant, et resuspendez les cellules dans l’inoculum de virus. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure avec agitation périodique.
Après cela, centrifuger la suspension cellulaire à 400 fois g pendant cinq minutes. Enlevez l’inoculum de virus, et lavez les cellules dans 1X médias complets d’IMDM. Culture des cellules dans des plaques de 96 ou 24 puits.
Dans cette étude, les cellules primaires de bursal de poulet sont successivement cultivés ex vivo en présence du ligand soluble de CD40 de poulet. Les cellules cultivés en présence de poulet soluble CD40 ligand sont vus pour augmenter de quatre fois de 902.000 à 3,63 millions par millilitre sur une période de six jours. La viabilité cellulaire est également considérablement améliorée en présence de poulet CD40 ligand.
Dans les images représentatives de microscopie confoccale, les cellules infectées sont considérées comme ayant une fluorescence verte autour du noyau, ce qui est compatible avec la présence d’IBDV dans le cytoplasme. Ceci est évident pour deux souches d’IBDV, une souche adaptée à la culture cellulaire, D78, et une souche très virulente, UK661. L’ARN est ensuite extrait à cinq, 18, 24 et 48 heures après l’infection et soumis à rt-qPCR avec des amorces spécifiques à une région conservée du gène IBDV VP4.
IBDV VP4 expression est vu pour augmenter à 16,603 exemplaires à 48 heures après l’infection avec D78 et à 38, 632 exemplaires à 48 heures postinfection avec UK661. Ces données démontrent que les cellules primaires de bursal de poulet peuvent soutenir la réplication des souches d’IBDV adaptées à la culture cellulaire et très virulentes. Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme rt-qPCR, microarray, ou ARN-Seq peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme la façon dont les cellules réagissent à l’infection.
Nous avons comparé la façon dont les cellules réagissent à l’infection par une souche atténuée et une souche très virulente de L’IBDV et notre étude actuelle de la façon dont elles réagissent à d’autres infections virales. La capacité de culture de ces cellules nous permet d’étudier des aspects de la pathogénie virale et de l’immunosuppression sans avoir besoin d’infecter les oiseaux. Cela aura un impact substantiel sur les trois R, le remplacement, le raffinement et la réduction de l’utilisation des animaux dans la recherche.
