Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la virología aviar, como cómo interactúan los virus inmunosupresores con las células B. La principal ventaja de esta técnica es que las células son más relevantes que las líneas celulares inmortalizadas que se utilizan actualmente en el laboratorio. Aunque este método proporciona información sobre cómo las células de pollo responden a la IBDV, también se puede aplicar a ALV y REV.
Este método reduce el número de aves en nuestra investigación, y es beneficioso para las tres R, que significa el reemplazo, reducción y refinamiento del uso de animales en la investigación. En un armario de seguridad microbiológico, lave el BF en 30 mililitros de PBS frío al menos tres veces. Transfiera el tejido lavado a un plato de Petri y agregue cinco mililitros de una solución de colagenasa D 1X.
Utilice tijeras estériles o una cuchilla de bisturí para cortar el BF en trozos de menos de cinco milímetros de diámetro. Incubar a 37 grados centígrados con agitación suave y periódica durante 30 minutos. Después de esto, utilice una pipeta Pasteur estéril para aspirar repetidamente la mezcla para fomentar la desintegración del tejido.
Añadir otros cinco mililitros de solución de 1X de colagenasa D al tejido, e incubarlo a 37 grados Celsius con agitación suave periódica durante otros 30 minutos. Repita este proceso, aspirando la mezcla, añadiendo solución de colágeno D fresca, e incubando hasta que el tejido se digiere por completo. Tenga en cuenta que habrá pequeños gránulos que no se disolverán más.
Pasar la suspensión celular digerida a través de un colador celular de 100 micras en 20 mililitros de 1X HBBS sin calcio. Centrifugar a 400 veces g durante cinco minutos. Desechar el sobrenadante, resuspender el pellet en 10 mililitros de 1X RPMI con 5%FBS.
A continuación, superponga 10 mililitros de la suspensión celular encima de cinco mililitros de medios de gradiente de densidad que contiene polisuuca y diatrizoato de sodio. Asegúrese de que hay una interfaz clara entre las dos capas. Centrifugar a 900 veces g y cuatro grados celsius durante 20 minutos.
Las celdas deben formar una banda en la interfaz entre los medios de celda y los medios de gradiente de densidad. A continuación, utilice una pipeta Pasteur estéril para extraer las células y transferirlas a un tubo que contenga PBS frío. Lavar las células centrifugandolas a 400 veces g durante cinco minutos y luego resuspendiéndolas en PBS frío.
Repita este lavado tres veces. En primer lugar, centrifugar la suspensión celular a 400 veces g durante cinco minutos. Resuspender las células en 30 mililitros de IMDM completo 1X.
Tome una alícuota de la suspensión celular y agréguela a una solución azul de Trypan. Cuente el número de celdas viables que excluyen el azul de Trypan y determine el número de celdas y el porcentaje de viabilidad. Después de esto, centrifugar la suspensión celular a 400 veces g durante cinco minutos.
Resuspender las células en IMDM completo complementado con una dilución de uno a 20 de pollo CD40 ligando a una densidad de 10 millones de células por mililitro. Cultivo de las células en placas de 96 o 24 pozos durante 48 a 72 horas. 48 a 72 horas después del aislamiento, descongelar una alícuota del virus.
Vórtice la muestra y guárdela en hielo. Resuspender las células bursal primarias en el medio IMDM. Tome una alícuota de 10 microlitros de la suspensión celular y agréguela a 10 microlitros de una solución azul de Trypan.
A continuación, determine el número de células y el porcentaje de viabilidad. Diluir el virus en IMDM completo 1X a la multiplicidad adecuada de infección para hacer que el virus se inóculo. Mezclar esta dilución por vórtice.
Centrifugar la suspensión celular a 400 g durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante y resuspendir las células en el inóculo del virus. Incubar a 37 grados centígrados durante una hora con agitación periódica.
Después de esto, centrifugar la suspensión celular a 400 veces g durante cinco minutos. Retire el inóculo del virus y lave las células en medios IMDM completos 1 veces. Cultivo de las células en placas de 96 o 24 pozos.
En este estudio, las células bursal primarias de pollo se cultivan sucesivamente ex vivo en presencia de ligando CD40 de pollo soluble. Las células cultivadas en presencia de ligando CD40 de pollo soluble se observan para aumentar cuatro veces de 902,000 a 3.63 millones por mililitro durante un período de seis días. La viabilidad celular también mejora significativamente en presencia de ligando de pollo CD40.
En las imágenes representativas de la microscopía confocal, se observa que las células infectadas tienen una fluorescencia verde alrededor del núcleo, que es consistente con la presencia de EII en el citoplasma. Esto es evidente para dos cepas de IBDV, una cepa adaptada al cultivo celular, D78, y una cepa muy virulenta, UK661. El ARN se extrae a las cinco, 18, 24 y 48 horas después de la infección y se somete a RT-qPCR con imprimaciones específicas de una región conservada del gen IBDV VP4.
Se observa que la expresión IBDV VP4 aumenta a 16 603 copias a las 48 horas después de la infección con D78 y a 38, 632 copias a las 48 horas después de la infección con UK661. Estos datos demuestran que las células bursal primarias de pollo pueden apoyar la replicación de cepas IBDV adaptadas al cultivo celular y muy virulentas. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como RT-qPCR, microarray o RNA-Seq para responder preguntas adicionales, como cómo las células responden a la infección.
Hemos comparado cómo las células responden a la infección con una cepa atenuada y una cepa muy virulenta de IBDV y ahora estamos investigando cómo responden a otras infecciones virales. La capacidad de cultivar estas células nos permite estudiar aspectos de la patogénesis del virus y la inmunosupresión sin necesidad de infectar a las aves. Esto tendrá un impacto sustancial en las tres R, la sustitución, el refinamiento y la reducción del uso de animales en la investigación.
