Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la localización de proteínas y la dinámica en organismos fotosintéticos. Al combinar el método de fotoblanca con el microscopio de superresor resolución, somos capaces de detectar la dinámica proteica de los organismos fotosintéticos en un detalle notable. Este método no sólo proporciona información sobre la dinámica proteica de Prochlorococcus.
También se puede aplicar a muchos otros organismos que contienen radio-re-dop-sing y bacterioclorofila. Demostrar este procedimiento será Yanxin Liu, un estudiante graduado de mi laboratorio. Para empezar, añada cinco mililitros de pro99 a base de agua de mar medio a un matraz de cultivo e inocularlo con un mililitro de Prochlorococcus MED4.
Crecer el Prochlorococcus a 23 grados Celsius bajo una luz con una intensidad de 35 fotones micromóleos por metro cuadrado. Después de cinco días, recoger un mililitro del cultivo en un tubo de 1,5 mililitros. Añadir 100 microlitros de formaldehído recién preparado al tubo para fijar el cultivo.
Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos. Luego, gire hacia abajo la muestra a 13, 500 veces G durante un minuto. Retire el sobrenadante y resusppend las células en 100 microlitros de medio Pro99.
Almacene la muestra a cuatro grados centígrados en la oscuridad hasta que esté lista para realizar la inmunosumanía. Primero, vórtice el vial de cuentas de poliestireno. Usando 50%etanol, preparar una dilución de uno a 20.000 como un lodo de trabajo.
Encienda la placa de cocción y ajuste la temperatura a 120 grados Centígrados. A continuación, coloque los cubreobjetos en la placa caliente. Cargue 100 microlitros de la suspensión de trabajo en cada cubreobjetos e incubar los cubreobjetos en la placa eléctrica durante 10 minutos.
A continuación, transfiera cuidadosamente los cubreobjetos a los platos de Petri del lado del cordón para almacenarlos a temperatura ambiente. Cuando esté listo para cubrir los cubreobjetos, recupere uno, asegurándose de que esté del lado del cordón hacia arriba. Añadir 100 microlitros de una solución de poli-L-lisina de un miligramo por mililitro al centro del cubreobjeto y dejar reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Después de esto, utilice una pipeta para aspirar cuidadosamente cualquier poli-lisina no atada y transfiérelo a un tubo de 1,5 mililitros. Almacene esta poli-L-lisina a cuatro grados Celsius para su uso posterior. Enjuague el cubreobjetos con 10 mililitros de agua ultrafiltrada en un plato Petri de 60 milímetros y luego séquelo brevemente con una toalla de papel.
Transfiera el cubreobjeto recubierto a un nuevo plato de Petri con Parafilm en la parte inferior, que se utilizará como plato de tinción. Cargue 100 microlitros de la muestra fija en el cubreobjetos y déjelo reposar durante 30 minutos para permitir la fijación de la célula. A continuación, utilice una toalla de papel para absorber la solución restante y luego transfiera el cubreobjetos a un pozo en una placa de 12 pozos para el lavado.
Agregue un mililitro de tampón PBS al pozo para lavar el cubreobjetos. A continuación, retire el PBS y agregue un mililitro de PBS fresco para lavar el cubreobjetos una segunda vez. Utilice una pipeta para extraer el PBS y reemplazarlo por un mililitro de tampón de permeabilización recién preparado.
Incubar el plato de lavado a 37 grados centígrados durante 20 minutos. A continuación, quite el búfer de permeabilización. Comience el proceso de lavado añadiendo un mililitro de tampón PBS fresco.
Coloque el plato de lavado en una coctelera para agitar suavemente el plato durante cinco minutos. Después de esto, retire el PBS y repita el proceso de lavado tres veces. Transfiera el cubreobjetos lavado al plato de tinción.
Agregue 50 microlitros de búfer de bloqueo en la parte superior del cubreobjetos. Coloque toda la bandeja de tinción sobre hielo y luego muévala debajo de la fuente de luz de xenón para fotoblanchar durante al menos 60 minutos. Después de fotoblanquear y bloquear, utilice el borde de una toalla de papel para quitar el búfer de bloqueo.
En primer lugar, diluir un microlitro de anticuerpo anti-FtsZ en 99 microlitros de tampón de bloqueo. Coloque 50 microlitros del anticuerpo primario diluido en el cubreobjetos e incimélo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera el cubreobjetos a un pozo del plato de lavado.
Para comenzar el lavado, agregue un mililitro de PBS. A continuación, transfiera el plato de lavado a una coctelera y agítelo suavemente durante cinco minutos. Retire el PBS y repita todo el proceso de lavado tres veces.
A continuación, transfiera el cubreobjetos a la placa de tinción. Coloque 50 microlitros del anticuerpo secundario diluido en el cubreobjetos e inciba en la oscuridad y a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transfiera el cubreobjetos de vuelta a la placa de lavado.
Para comenzar el lavado, agregue un mililitro de PBS. Envuelva el plato de lavado en papel de aluminio para protegerlo de la luz. Transfiera el plato a la coctelera y agítela suavemente durante cinco minutos.
Retire el PBS y repita todo el proceso de lavado tres veces. Inmediatamente antes de la toma de imágenes STORM, prepare un mililitro de búfer de imágenes como se describe en el protocolo de texto. Cargue el cubreobjetos en la cámara de carga.
Agregue el tampón de imágenes recién preparado, siendo suave para evitar lavar las células cianobacterianas. Después de esto, coloque un cubreobjetos rectangular en la parte superior del búfer de imágenes para evitar que reaccione con el oxígeno en el aire. Encienda la cámara, la luz LED y el láser, y abra el software STORM.
Agregue media gota de aceite de inmersión en la parte superior de la lente. Cargue la cámara, asegurándose de que el objetivo esté haciendo contacto con el cubreobjetos. Y examine la señal con un láser de 750 nanómetros.
Identifique un área de muestra que contenga celdas y marcadores fiduciarios. A continuación, inicie el software para la corrección de deriva de muestra. Adquiera una imagen de archivo ancho como referencia, con la ganancia de multiplicación de electrones de la cámara a 300 y un tiempo de exposición de 30 milisegundos.
Aumente la intensidad del láser de excitación de 750 nanómetros a aproximadamente 4,5 kilovatios por centímetro cuadrado. Una vez que los fluoróforos han pasado a un patrón de parpadeo disperso, adquiera una imagen de super resolución recogiendo 10.000 fotogramas a 33 hercios. A continuación, reconstruya las imágenes de superprosorción a partir de los datos sin procesar como se describe en el protocolo de texto.
En este estudio, STORM se utiliza para lograr imágenes de super-resolución mediante la activación de fluoróforos foto-conmutables individuales estocásticamente. Se registra la ubicación de cada fluoróforo y se construye una imagen de super resolución basada en estas ubicaciones. Mientras que los espectros de absorción de Prochlorococcus alcanzan un máximo de 447 y 680 nanómetros y tienen una absorción mínima superior a 700 nanómetros, las células de Prochlorococcus MED4 todavía emiten alta autofluorescencia cuando se exponen a una intensidad extremadamente alta del láser de 750 nanómetros, que se requiere para la toma de imágenes STORM.
Después de usar el método de fotoblanqueo descrito aquí durante 30 minutos, se observa que la autofluorescencia de las células disminuye, aunque todavía se detectan varias células con autofluorescencia. El alargamiento del fotoblancar a 60 minutos hace que la mayoría de las células pierdan su autofluorescencia. Estos resultados indican que el método de fotoblanquido desarrollado es capaz de reducir en gran medida la autofluorescencia de los organismos fotosintéticos.
Después del fotoblancada, STORM se utiliza para visualizar la proteína de división celular, FtsZ, en las células. Usando STORM, se revela una morfología detallada del anillo FtsZ. Al rotar las imágenes 3D STORM, se identificaron cuatro tipos diferentes de morfologías, racimos, un anillo incompleto, un anillo completo y anillos dobles.
Es importante recordar que la intensidad de la luz y la duración del fotoblanqueo pueden diferir para diferentes organismos. Después de su desarrollo, este método allana el camino para los investigadores que quieren estudiar la organización de proteínas y la función potencial en las células fotosintéticas en detalle.
