自发荧光成像评估红藻生理学

这种共聚焦显微镜方案将允许使用其色素的自发荧光在实验室中解释微藻的生态行为和适应，这些环境在实验室中生长缓慢。这种技术不是侵入性的，并且由于不使用化合物，因此可以最大限度地减少伪影。了解自养生物色素的性能和相应的生长将允许设计控制方法，这是旅游洞穴和建筑古迹的最大兴趣。

通过将Chroothece mobilis的接种物从琼脂培养物转移到海水培养基或SWES液体培养基中，开始制备Chroothece mobilis的接种物。在低白光强度下，在20摄氏度下用16至8光暗光周期将所有培养物维持两周，并且不摇晃，直到获得所需的细胞密度。使用一毫升指数期培养物，每毫升细胞密度为10至第三个细胞的五倍，接种在24孔板中用于不同的实验。

为了重现单色光效果，请使用绿色滤光片，允许绿光从 470 到 570 纳米通过，峰值在 506 纳米波长处，并使用 590 到 720 纳米之间的滤光片调整红光，峰值在 678 纳米。将细胞培养物暴露在这种光线下两周。打开倒置共聚焦激光扫描显微镜的所有组件，包括激光器。

将细胞从24孔板的每个实验孔安装在SWES生长培养基中，到35毫米玻璃底培养皿中进行成像。选择63X或1.30数值孔径或NA甘油浸没物镜，并将甘油放在镜头上。接下来，将孔板放在显微镜载物台上，确保标本在图像采集过程中不会移动。

通过选择荧光强度最高的平面，将标本置于光路的中心，并聚焦在细胞的中心。完成后，打开图像采集软件，从采集模式的下拉列表中选择XY lambda。选择激光的激发线 561 纳米、8 位动态范围和 1024 x 1024 像素。

在 10 纳米带宽内收集荧光发射光谱和 570 至 760 纳米范围内 4 纳米的λ步长。将针孔设置在一个空气单元上并运行λ扫描采集。在不同的视野和红绿灯的不同条件下重复此过程后，保存所有数据。

获取λ扫描后，单击软件顶部的量化窗口以评估收集的荧光发射光谱。转到打开的项目窗口，然后选择一个 XY lambda 文件。在成像软件中选择堆叠轮廓分析，并在细胞中心定义一个四微米见方的感兴趣区域，以分析平均荧光强度。

导出数据和 CSV，然后在不同条件下对不同的单元格重复该过程。接下来，打开CSV文件，通过在CSV文件中分别选择藻红蛋白藻蓝蛋白、藻蓝蛋白、别藻蓝蛋白和叶绿素A的最大荧光数据，打开CSV文件以选择所有被测区域的不同荧光发射峰。完成后，创建一个新表，其中包含从每个藻胆蛋白和叶绿素峰获得的所有最大荧光值，并将数据绘制在图表上。

观察到平均荧光强度的显着差异。当细胞暴露于单色绿光时，藻红蛋白藻蓝蛋白的平均荧光强度显着降低。相比之下，与对照组相比，红光没有观察到差异。

绿光对别藻蓝蛋白和叶绿素A具有相反的影响，其中平均荧光强度显着增加，这是由于天线复合物的数量增加或连接性改善而导致天线复合物的适应。红光产生别藻蓝蛋白和叶绿素荧光的不显着增加.为了研究不同生长条件对培养细胞的影响，使用完全相同的显微镜设置进行测量至关重要。

可以分析与自发荧光生物培养相关的其他环境参数，以及可见光谱内的荧光信号。该技术是研究具有几种自发荧光色素的生命生物体的一种非常有效的方法。