Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre localização de proteínas e a dinâmica em organismos fotossintéticos. Combinando o método de fotobleaching com microscópio de super-resolução, somos capazes de detectar a dinâmica proteica de organismos fotossintéticos em um detalhe notável. Este método não só fornece uma visão da dinâmica proteica do Prochlorococcus.
Também pode ser aplicado a muitos outros organismos que contêm radio-re-dop-sing e bacteriochlorophyll. Demonstrando este procedimento será Yanxin Liu, um estudante de pós-graduação do meu laboratório. Para começar, adicione cinco mililitros de meio Pro99 à base de água do mar a um frasco de cultura e inocula-o com um mililitro de Prochlorococcus MED4.
Cresça o Prochlorococcus a 23 graus Celsius sob uma luz com uma intensidade de 35 fótons micromole por metro quadrado. Depois de cinco dias, colete um mililitro da cultura em um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 100 microliters de formaldeído recém-preparado ao tubo para corrigir a cultura.
Incubar no escuro à temperatura ambiente por 20 minutos. Em seguida, gire a amostra a 13.500 vezes G por um minuto. Remova o supernascer e resuspenja as células em 100 microliters do meio Pro99.
Armazene a amostra a quatro graus Celsius no escuro até que esteja pronto para realizar a imunostaining. Primeiro, vórtice o frasco de contas de poliestireno. Usando 50% de etanol, prepare uma diluição de 1 a 20.000 como um chorume de trabalho.
Ligue a placa quente e afina a temperatura para 120 graus Celsius. Em seguida, coloque as tampas na placa quente. Carregue 100 microliters do chorume de trabalho em cada tampa e incubar as tampas na placa de aquecimento por 10 minutos.
Em seguida, transfira cuidadosamente as tampas para as placas de Petri para armazenamento à temperatura ambiente. Quando estiver pronto para revestir as tampas, recupere uma, certificando-se de que ela esteja do lado das contas para cima. Adicione 100 microliters de uma solução de um miligrama por mililitro de poli-L-lisina ao centro da fenda e deixe-o sentado em temperatura ambiente por 30 minutos.
Depois disso, use uma pipeta para aspirar cuidadosamente qualquer poli-l-lysina nãoectada e transfira-a para um tubo de 1,5 mililitro. Armazene esta poli-L-lysine a quatro graus Celsius para uso posterior. Enxágüe o deslizamento com 10 mililitros de água ultra filtrada em uma placa de Petri de 60 milímetros e, em seguida, seque-o brevemente com uma toalha de papel.
Transfira o talo revestido para uma nova placa de Petri com Parafilm na parte inferior, que será usada como a placa de coloração. Carregue 100 microliters da amostra fixa no deslizamento de tampas e deixe descansar por 30 minutos para permitir o apego celular. Em seguida, use uma toalha de papel para absorver a solução restante e, em seguida, transfira o deslizamento de tampas para um poço em uma placa de 12 poços para lavar.
Adicione um mililitro de tampão PBS ao poço para lavar a tampa. Em seguida, remova o PBS e adicione um mililitro de PBS fresco para lavar o deslizamento de tampas uma segunda vez. Use uma pipeta para remover o PBS e substitua-o por um mililitro de tampão de permeabilização recém-preparado.
Incubar a assada a 37 graus Celsius por 20 minutos. Em seguida, remova o tampão de permeabilização. Inicie o processo de lavagem adicionando um mililitro de tampão PBS fresco.
Coloque o prato de lavagem em um agitador para agitar suavemente o prato por cinco minutos. Depois disso, remova o PBS e repita o processo de lavagem três vezes. Transfira a mancha lavada para o prato de coloração.
Adicione 50 microliters de tampão de bloqueio na parte superior da tampa. Coloque todo o prato de coloração no gelo e, em seguida, mova-o sob a fonte de luz de xenônio para fotobleaching por pelo menos 60 minutos. Depois de fotobleachar e bloquear, use a borda de uma toalha de papel para remover o tampão de bloqueio.
Primeiro, diluir um microliter de anticorpo anti-FtsZ em 99 microliters de tampão de bloqueio. Coloque 50 microliters do anticorpo primário diluído no deslizamento de tampas e incuba-o à temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira o deslizamento para um poço do prato de lavagem.
Para começar a lavagem, adicione um mililitro de PBS. Em seguida, transfira o prato de lavagem para um agitador e agite-o suavemente por cinco minutos. Retire o PBS e repita todo o processo de lavagem três vezes.
Em seguida, transfira o deslizamento de cobertura para o prato de coloração. Coloque 50 microliters do anticorpo secundário diluído sobre o deslizamento de tampas e incuba-o no escuro e à temperatura ambiente por 30 minutos. Transfira o deslizamento de volta para o prato de lavagem.
Para começar a lavagem, adicione um mililitro de PBS. Enrole o prato de lavagem em papel alumínio para protegê-lo da luz. Transfira a placa para o agitador e agite-a suavemente por cinco minutos.
Retire o PBS e repita todo o processo de lavagem três vezes. Imediatamente antes da imagem STORM, prepare um mililitro de tampão de imagem conforme descrito no protocolo de texto. Coloque a tampa na câmara de carregamento.
Adicione o tampão de imagem recém-preparado, sendo suave para evitar lavar as células cianobacterianas. Depois disso, coloque uma mancha retangular em cima do tampão de imagem para evitar que ele reaja com o oxigênio no ar. Ligue a câmera, a luz LED e o laser, e abra o software STORM.
Adicione meia gota de óleo de imersão em cima da lente. Carregue a câmara, certificando-se de que a lente objetiva está fazendo contato com a tampa. E examine o sinal com um laser de 750 nanômetros.
Identifique uma área amostral que contenha células e marcadores fiduciários. Em seguida, inicie o software para correção de deriva de amostra. Adquira uma imagem ampla como referência, com o ganho de multiplicação de elétrons da câmera em 300 e um tempo de exposição de 30 milissegundos.
Aumente a intensidade do laser de excitação de 750 nanômetros para aproximadamente 4,5 quilowatts por centímetro quadrado. Uma vez que os fluoroforos tenham transitado para um padrão de piscar esparso, adquira uma imagem de super resolução coletando 10.000 quadros a 33 hertz. Em seguida, reconstrua as imagens de super-resolução a partir dos dados brutos, conforme descrito no protocolo de texto.
Neste estudo, o STORM é usado para obter imagens de super resolução ativando fluoroforos foto-comutação individual estochasticamente. A localização de cada fluoróforo é registrada, e uma imagem de super resolução é então construída com base nesses locais. Enquanto o espectro de absorção de Prochlorococcus atinge picos de 447 e 680 nanômetros e tem absorção mínima acima de 700 nanômetros, as células Prochlorococcus MED4 ainda emitem alta autofluorescência quando expostas a uma intensidade extremamente alta do laser de 750 nanômetros, o que é necessário para imagens STORM.
Depois de usar o método de fotobleaching descrito aqui por 30 minutos, a autofluorescência das células é vista para diminuir, embora várias células com autofluorescência ainda sejam detectadas. Alongar o fotobleaching para 60 minutos resulta na maioria das células perdendo sua autofluorescência. Esses resultados indicam que o método de fotobleaching desenvolvido é capaz de reduzir consideravelmente a autofluorescência de organismos fotossintéticos.
Após a fotobleaching, storm é usado para visualizar a proteína de divisão celular, FtsZ, nas células. Usando STORM, uma morfologia detalhada do anel FtsZ é revelada. Ao girar as imagens 3D STORM, foram identificados quatro tipos diferentes de morfologias, aglomerados, um anel incompleto, um anel completo e anéis duplos.
É importante lembrar que a intensidade da luz e duração do fotobleach podem diferir para diferentes organismos. Após seu desenvolvimento, esse método abre caminho para pesquisadores que desejam estudar a organização de proteínas e a função potencial em células fotossintéticas em detalhes.
