يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول توطين البروتين وديناميات الكائنات الضوئية. من خلال الجمع بين طريقة الضوبلاخ مع المجهر فائقة الدقة ، ونحن قادرون على الكشف عن ديناميات البروتين من الكائنات الضوئية في تفاصيل ملحوظة. هذه الطريقة لا توفر فقط نظرة ثاقبة في ديناميات البروتين من Prochlorococcus.
ويمكن أيضا أن تطبق على العديد من الكائنات الحية الأخرى التي تحتوي على الراديو dop - ينغ وbacteriochlorophyll. إثبات هذا الإجراء سيكون يانشين ليو، وهو طالب دراسات عليا من مختبري. للبدء، إضافة خمسة ملليلترات من مياه البحر القائمة Pro99 المتوسطة إلى قارورة الثقافة وتطعيمه مع ملليلتر واحد من Prochlorococcus MED4.
تنمو Prochlorococcus في 23 درجة مئوية تحت ضوء مع كثافة 35 فوتونات ميكرومول لكل متر مربع. بعد خمسة أيام، وجمع ملليلتر واحد من الثقافة في أنبوب 1.5 ملليلتر. إضافة 100 ميكرولترات من الفورمالديهايد الطازجة أعدت إلى أنبوب لإصلاح الثقافة.
احتضان في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. ثم، تدور أسفل العينة في 13، 500 مرات G لمدة دقيقة واحدة. إزالة فائقة وإعادة ضغط الخلايا في 100 ميكرولترات من Pro99 المتوسطة.
تخزين العينة في أربع درجات مئوية في الظلام حتى جاهزة لأداء المثبطات المناعية. أولا، دوامة قارورة حبات البوليسترين. باستخدام 50٪ الإيثانول، وإعداد واحد إلى 20، 000 تخفيف كملاط العمل.
بدوره على الساخن وتعيين درجة الحرارة إلى 120 درجة مئوية. بعد ذلك، ضع الأغطية على لوحة ساخنة. تحميل 100 ميكرولترات من الطين العمل على كل غطاء واحتضان الأغطية على اللوح الساخن لمدة 10 دقائق.
ثم نقل بعناية الأغطية إلى أطباق بيتري خرز الجانب للتخزين في درجة حرارة الغرفة. عندما تكون على استعداد لمعطف الأغطية، واسترداد واحد، والتأكد من أنه هو الجانب الخرز. إضافة 100 ميكرولتر من ملليغرام واحد لكل ملليلتر بولي-L-ليسين حل إلى مركز الغطاء والسماح لها الجلوس في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
بعد ذلك، استخدمي ماصة لتسبيب أي بولي-إل-ليسين غير مرتبط ونقله إلى أنبوب 1.5 ملليلتر. تخزين هذا بولي-L-ليسين في أربع درجات مئوية لاستخدامها في وقت لاحق. شطف الأغطية مع 10 ملليلتر من الماء المصفى جدا في طبق بيتري 60 ملليمتر ثم يجف لفترة وجيزة مع منشفة ورقية.
نقل الأغطية المغلفة إلى طبق بيتري جديد مع بارا فيلم في الجزء السفلي، والتي سيتم استخدامها كطبق تلطيخ. تحميل 100 ميكرولترات من عينة ثابتة على غطاء والسماح لها الجلوس لمدة 30 دقيقة للسماح مرفق الخلية. بعد ذلك، استخدم منشفة ورقية لاستيعاب الحل المتبقي ثم نقل الغطاء إلى بئر في طبق من 12 بئر للغسيل.
إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت PBS إلى البئر لغسل الغطاء. ثم إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني جديد لغسل غطاء مرة ثانية. استخدام ماصة لإزالة برنامج تلفزيوني واستبداله بميليلتر واحد من عازلة permeabilization أعدت حديثا.
احتضان طبق الغسيل في 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم قم بإزالة المخزن المؤقت permeabilization. بدء عملية الغسيل عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المخزن المؤقت PBS الطازجة.
وضع طبق الغسيل على شاكر لتهيج بلطف الطبق لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بإزالة برنامج تلفزيوني وكرر عملية الغسيل ثلاث مرات. نقل الأغطية المغسولة إلى طبق تلطيخ.
إضافة 50 ميكرولترات من العازلة حظر في الجزء العلوي من غطاء. ضع طبق التلطيخ بأكمله على الجليد ثم حركه تحت مصدر الضوء زينون للإضاءة الضوئية لمدة 60 دقيقة على الأقل. بعد الحجب الضوئي والحجب، استخدم حافة منشفة ورقية لإزالة المخزن المؤقت للحظر.
أولاً، تمييع ميكرولتر واحد من الأجسام المضادة FtsZ إلى 99 ميكرولترات من عازلة الحجب. ضع 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الأولية المخففة على غطاء الغطاء وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل غطاء إلى بئر من طبق الغسيل.
لبدء الغسيل، أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. ثم نقل طبق الغسيل إلى شاكر ويهز بلطف لمدة خمس دقائق. إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار عملية الغسيل بأكملها ثلاث مرات.
بعد ذلك، نقل الغطاء إلى طبق تلطيخ. ضع 50 ميكرولترات من الأجسام المضادة الثانوية المخففة على الغطاء واحتضانه في الظلام وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. نقل غطاء الأغطية مرة أخرى إلى طبق الغسيل.
لبدء الغسيل، أضف ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني. لف طبق الغسيل في رقائق الألومنيوم لحمايته من الضوء. نقل لوحة إلى شاكر وتهز بلطف لمدة خمس دقائق.
إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار عملية الغسيل بأكملها ثلاث مرات. مباشرة قبل التصوير STORM، إعداد ملليلتر واحد من مخزن التصوير المؤقت كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتحميل الغطاء في غرفة التحميل.
أضف عازل التصوير المعد حديثًا، مع كونه لطيفًا لتجنب غسل الخلايا البكتيرية الزرقاء. بعد ذلك، ضع غطاء مستطيل على أعلى المخزن المؤقت للتصوير لمنعه من التفاعل مع الأكسجين في الهواء. قم بتشغيل الكاميرا وإضاءة LED والليزر، وافتح برنامج STORM.
إضافة نصف قطرة من زيت الغمر على أعلى العدسة. تحميل الغرفة ، والتأكد من أن العدسة الهدف هو جعل الاتصال مع coverslip. وتفحص الإشارة مع ليزر 750 نانومتر.
تحديد منطقة عينة تحتوي على كل من الخلايا وعلامات fiducial. ثم بدء تشغيل البرنامج لتصحيح العينة الانجراف. الحصول على صورة واحدة عريضة المستويات كمرجع ، مع زيادة ضرب الإلكترون الكاميرا في 300 ووقت التعرض من 30 مللي ثانية.
زيادة 750 نانومتر ثيرتريشن شدة الليزر إلى ما يقرب من 4.5 كيلوواط لكل سنتيمتر مربع. بمجرد انتقال الفلوروفور إلى نمط وامض متفرق ، احصل على صورة واحدة فائقة الدقة من خلال جمع 10000 إطار في 33 هرتز. ثم إعادة بناء الصور فائقة الدقة من البيانات الخام كما هو موضح في بروتوكول النص.
في هذه الدراسة، يتم استخدام STORM لتحقيق التصوير فائق الدقة من خلال تفعيل الفلوروبهورس الفردية القابلة للتبديل بشكل عشوائي. يتم تسجيل موقع كل فلوريوفور، ثم يتم بناء صورة فائقة الدقة بناء على هذه المواقع. في حين أن أطياف الامتصاص من بروكوروككوس قمم في 447 و 680 نانومتر والحد الأدنى من الامتصاص فوق 700 نانومتر، لا تزال خلايا Prochlorococcus MED4 تنبعث منها ارتفاع الفلوروس عندما تتعرض لأشعة الليزر 750 نانومتر عالية للغاية، وهو أمر مطلوب لتصوير العاصفة.
بعد استخدام طريقة التحسس الضوئي الموضحة هنا لمدة 30 دقيقة ، وينظر إلى الخلايا 'autofluorescence إلى الانخفاض ، على الرغم من أن العديد من الخلايا مع autofluorescence لا تزال تكتشف. استطالة photobleaching إلى 60 دقيقة النتائج في معظم الخلايا فقدان autofluorescence. هذه النتائج تشير إلى أن طريقة photobleaching المتقدمة قادرة على الحد بشكل كبير من الفلوروس من الكائنات الضوئية.
بعد الضوبلاخ، يتم استخدام STORM لتصور بروتين انقسام الخلايا، FtsZ، في الخلايا. باستخدام STORM ، يتم الكشف عن مورفولوجيا مفصلة من حلقة FtsZ. من خلال تدوير صور STORM ثلاثية الأبعاد ، تم تحديد أربعة أنواع مختلفة من المورفولوغات ، والعناقيد ، وحلقة غير مكتملة ، وحلقة كاملة ، وحلقات مزدوجة.
من المهم أن نتذكر أن شدة الضوء ومدة photobleach قد تختلف بالنسبة للكائنات الحية المختلفة. بعد تطورها ، تمهد هذه الطريقة الطريق للباحثين الذين يرغبون في دراسة تنظيم البروتين والوظيفة المحتملة في الخلايا الضوئية بالتفصيل.
