Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la localisation des protéines et la dynamique des organismes photosynthétiques. En combinant la méthode de photobleaching avec le microscope à super résolution, nous sommes en mesure de détecter la dynamique protéique des organismes photosynthétiques dans un détail remarquable. Cette méthode permet non seulement de mieux comprendre la dynamique protéique du Prochlorococcus.
Il peut également être appliqué à de nombreux autres organismes contenant radio-re-dop-sing et bactériophylle. Yanxin Liu, un étudiant diplômé de mon laboratoire, démontrera cette procédure. Pour commencer, ajoutez cinq millilitres de pro99 moyen à base d’eau de mer à un flacon de culture et inoculez-le avec un millilitre de Prochlorococcus MED4.
Cultivez le Prochlorococcus à 23 degrés Celsius sous une lumière avec une intensité de 35 photons micromole par mètre carré. Après cinq jours, recueillir un millilitre de la culture dans un tube de 1,5 millilitre. Ajouter 100 microlitres de formaldéhyde fraîchement préparé au tube pour fixer la culture.
Incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant 20 minutes. Ensuite, faites tourner l’échantillon à 13 500 fois G pendant une minute. Enlevez le supernatant et réutilisez les cellules en 100 microlitres de pro99 moyen.
Conserver l’échantillon à quatre degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer l’immunostaining. Tout d’abord, vortex le flacon de perles de polystyrène. En utilisant 50% d’éthanol, préparez une dilution de 1 à 20 000 comme boue de travail.
Allumez la plaque chauffante et réglez la température à 120 degrés Celsius. Ensuite, placez les coverslips sur la plaque chaude. Chargez 100 microlitres de la boue de travail sur chaque coverslip et incuber les coverslips sur la plaque chauffante pendant 10 minutes.
Ensuite, transférez soigneusement les coverslips sur les boîtes de Pétri côté perle vers le haut pour le stockage à température ambiante. Lorsqu’il est prêt à enduire les coverslips, récupérer un, en s’assurant qu’il est côté perle vers le haut. Ajouter 100 microlitres d’un milligramme par millilitre de solution poly-L-lysine au centre du coverslip et laisser reposer à température ambiante pendant 30 minutes.
Après cela, utilisez une pipette pour aspirer soigneusement toute poly-L-lysine non attachée et la transférer dans un tube de 1,5 millilitre. Conservez cette poly-L-lysine à quatre degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Rincer le coverslip avec 10 millilitres d’eau ultra filtrée dans une boîte petri de 60 millimètres, puis le sécher brièvement avec une serviette en papier.
Transférer le coverslip enduit dans une nouvelle boîte de Pétri avec parafilm en bas, qui sera utilisé comme plat de coloration. Chargez 100 microlitres de l’échantillon fixe sur le coverslip et laissez-le reposer pendant 30 minutes pour permettre l’attachement cellulaire. Ensuite, utilisez une serviette en papier pour absorber la solution restante, puis transférez le coverslip dans un puits dans une assiette de 12 puits pour le lavage.
Ajouter un millilitre de tampon PBS au puits pour laver le coverslip. Retirez ensuite le PBS et ajoutez un millilitre de PBS frais pour laver le coverslip une deuxième fois. Utilisez une pipette pour enlever le PBS et le remplacer par un millilitre de tampon de perméabilisation fraîchement préparé.
Incuber le plat à laver à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes. Retirez ensuite le tampon de perméabilisation. Commencez le processus de lavage en ajoutant un millilitre de tampon PBS frais.
Déposer le plat à laver sur un shaker pour agiter doucement le plat pendant cinq minutes. Après cela, retirez le PBS et répétez le processus de lavage trois fois. Transférer le coverslip lavé dans le plat à taches.
Ajouter 50 microlitres de tampon de blocage sur le dessus du coverslip. Placez tout le plat de coloration sur la glace, puis déplacez-le sous la source lumineuse du xénon pour le photobleaching pendant au moins 60 minutes. Après le photobleaching et le blocage, utilisez le bord d’une serviette en papier pour enlever le tampon de blocage.
Tout d’abord, diluer un microlitre d’anticorps anti-FtsZ en 99 microlitres de tampon de blocage. Placez 50 microlitres de l’anticorps primaire dilué sur le coverslip et incubez-le à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer le coverslip dans un puits du plat à laver.
Pour commencer le lavage, ajouter un millilitre de PBS. Transférer ensuite le plat à laver dans un shaker et le secouer doucement pendant cinq minutes. Retirez le PBS et répétez l’ensemble du processus de lavage trois fois.
Ensuite, transférez le coverslip dans le plat de coloration. Placez 50 microlitres de l’anticorps secondaire dilué sur le coverslip et incubez-le dans l’obscurité et à température ambiante pendant 30 minutes. Transférer le coverslip dans le plat à laver.
Pour commencer le lavage, ajouter un millilitre de PBS. Envelopper le plat de lavage dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Transférer la plaque sur le shaker et la secouer doucement pendant cinq minutes.
Retirez le PBS et répétez l’ensemble du processus de lavage trois fois. Immédiatement avant l’imagerie STORM, préparez un millilitre de tampon d’imagerie tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Chargez le coverslip dans la chambre de chargement.
Ajouter le tampon d’imagerie fraîchement préparé, en étant doux pour éviter de laver les cellules cyanobactériennes. Après cela, placez un coverslip rectangulaire sur le tampon d’imagerie pour l’empêcher de réagir avec l’oxygène dans l’air. Allumez la caméra, la lumière LED et le laser, et ouvrez le logiciel STORM.
Ajouter une demi-goutte d’huile d’immersion sur le dessus de la lentille. Chargez la chambre, en vous assurant que l’objectif est en contact avec le coverslip. Et examinez le signal avec un laser de 750 nanomètres.
Identifier une zone d’échantillon qui contient à la fois des cellules et des marqueurs fiduciaux. Ensuite, démarrez le logiciel pour la correction de dérive de l’échantillon. Acquérir une image largement déposée comme référence, avec le gain de multiplication des électrons de la caméra à 300 et un temps d’exposition de 30 millisecondes.
Augmentez l’intensité du laser d’excitation de 750 nanomètres à environ 4,5 kilowatts par centimètre carré. Une fois que les fluorophores ont fait la transition vers un motif de clignotement clairsemé, acquérir une image super-résolution en collectant 10 000 images à 33 hertz. Reconstruisez ensuite les images de super-résolution à partir des données brutes décrites dans le protocole texte.
Dans cette étude, STORM est utilisé pour obtenir une imagerie à super résolution en activant stochastically fluorophores photo-commutables individuels. L’emplacement de chaque fluorophore est enregistré, et une image de super-résolution est ensuite construite en fonction de ces emplacements. Alors que les spectres d’absorption de Prochlorococcus culminent à 447 et 680 nanomètres et ont une absorption minimale supérieure à 700 nanomètres, les cellules Prochlorococcus MED4 émettent encore une autofluorescence élevée lorsqu’elles sont exposées à une intensité extrêmement élevée du laser de 750 nanomètres, ce qui est nécessaire pour l’imagerie STORM.
Après avoir utilisé la méthode de photobleaching décrite ici pendant 30 minutes, l’autofluorescence des cellules est vue pour diminuer, bien que plusieurs cellules avec l’autofluorescence soient toujours détectées. L’allongement de la photobleaching à 60 minutes entraîne la perte de l’autofluorescence de la majorité des cellules. Ces résultats indiquent que la méthode de photobleaching développée est capable de réduire considérablement l’autofluorescence des organismes photosynthétiques.
Après la photobleaching, STORM est utilisé pour visualiser la protéine de division cellulaire, FtsZ, dans les cellules. À l’aide de STORM, une morphologie détaillée de l’anneau FtsZ est révélée. En tournant les images STORM 3D, quatre types différents de morphologies ont été identifiés, des grappes, un anneau incomplet, un anneau complet et des anneaux doubles.
Il est important de se rappeler que l’intensité lumineuse et la durée du photobleach peuvent différer pour différents organismes. Après son développement, cette méthode ouvre la voie aux chercheurs qui veulent étudier l’organisation des protéines et la fonction potentielle dans les cellules photosynthétiques en détail.
