이 방법은 단백질 국소화와 광합성 유기체의 역학에 대한 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 광표백 방법과 초해상도 현미경을 결합하여 광합성 유기체의 단백질 역학을 놀라운 세부 사항으로 감지할 수 있습니다. 이 방법은 프로클로로코커스의 단백질 역학에 대한 통찰력을 제공합니다.
그것은 또한 무선 재 도프 노래 및 박테리오 클로로소필을 포함하는 많은 다른 유기체에 적용될 수 있습니다. 이 절차를 시연하는 것은 내 실험실에서 대학원생 인 얀신 리우 (Yanxin Liu)가 될 것입니다. 우선, 배양 플라스크에 바닷물 기반 의 Pro99 배지 의 5 밀리리터를 추가하고 프로 클로로 코커스 MED4의 1 밀리리터로 접종.
평방 미터당 35 마이크로몰 광자의 강도와 빛 아래 섭씨 23도에서 프로 클로로 코커스를 성장. 5 일 후, 1.5 밀리 리터 튜브에 문화의 1 밀리 리터를 수집합니다. 문화를 고치기 위해 새로 준비된 포름알데히드 100마이크로리터를 튜브에 추가합니다.
실온에서 20분 동안 어둠 속에서 배양하세요. 그런 다음 1 분 동안 13, 500 회 G에서 샘플을 회전시합니다. Pro99 배지의 100 마이크로리터에서 상체를 제거하고 세포를 다시 분리합니다.
면역 염색을 수행 할 준비가 될 때까지 어둠 속에서 섭씨 4도에 샘플을 저장합니다. 첫째, 폴리스티렌 구슬의 유리병을 소용돌이. 50%에탄올을 사용하여 1대 20, 000 희석을 작동 슬러리로 준비합니다.
핫플레이트를 켜고 온도를 섭씨 120도로 설정합니다. 다음으로 커버립을 핫 플레이트에 놓습니다. 작업 슬러리 100 마이크로리터를 각 커버슬립에 적재하고 핫플레이트의 커버립을 10분 동안 배양합니다.
그런 다음 커버립을 페트리 접시비드 사이드위로 조심스럽게 옮겨 실온에서 보관합니다. 커버립을 코팅할 준비가 되면 하나를 검색하여 구단 쪽위로 위로 올라섭도록 합니다. 밀리리터 폴리-L-리신 용액 1밀리그램 100마이크로리터를 커버슬립 중앙에 넣고 30분 동안 실온에 앉게 합니다.
그런 다음 파이펫을 사용하여 부착되지 않은 폴리 L-리신을 조심스럽게 흡인하고 1.5 밀리리터 튜브로 전송합니다. 이 폴리 L-리신을 섭씨 4도에 저장하여 나중에 사용할 수 있습니다. 60mm 페트리 접시에 울트라 여과된 물 10밀리리터로 커버슬립을 헹구고 종이 타월로 짧게 건조시다.
코팅 된 커버 슬립을 바닥에 파라 필름과 함께 새로운 페트리 접시로 옮기면 염색 요리로 사용됩니다. 고정 된 샘플의 100 마이크로 리터를 커버 슬립에로드하고 세포 부착을 허용하기 위해 30 분 동안 앉아있게하십시오. 다음으로, 종이 타월을 사용하여 남은 용액을 흡수한 다음 커버슬립을 12웰 플레이트에 넣고 세탁합니다.
커버슬립을 세척하기 위해 PBS 버퍼 1밀리리터를 웰에 추가합니다. 그런 다음 PBS를 제거하고 신선한 PBS의 밀리리터 를 추가하여 커버슬립을 두 번째로 씻어낸다. 파이펫을 사용하여 PBS를 제거하고 새로 준비된 충류 버퍼 1밀리리터로 교체하십시오.
20분 동안 섭씨 37도에서 세탁접시를 배양합니다. 그런 다음 투과화 버퍼를 제거합니다. 신선한 PBS 버퍼의 1 밀리리터를 추가하여 세척 과정을 시작합니다.
세척 접시를 셰이커에 놓고 5분간 부드럽게 접시를 어기십시오. 그 후 PBS를 제거하고 세번 세척 과정을 반복합니다. 세척된 커버슬립을 염색 접시에 옮기습니다.
커버슬립 상단에 블로킹 버퍼 50마이크로리터를 추가합니다. 전체 염색 접시를 얼음 위에 놓고 크세논 광원 아래에 이동하여 최소 60분 동안 광표백을 합니다. 표백 및 차단 후 종이 타월 가장자리를 사용하여 차단 버퍼를 제거합니다.
첫째, 안티 FtsZ 항체의 마이크로리터 1개를 블로킹 버퍼의 99 마이크로리터로 희석시. 희석된 1차 항체 50마이크로리터를 커버슬립에 놓고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 커버슬립을 세탁접시의 우물로 옮기.
세척을 시작하려면 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 세척 접시를 셰이커에 옮기고 부드럽게 5 분간 흔들어 줍니다. PBS를 제거하고 전체 세척 과정을 세 번 반복합니다.
다음으로, 커버슬립을 염색 접시에 옮기습니다. 희석된 이차 항체의 50마이크로리터를 커버슬립에 놓고 어둡고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 커버슬립을 세탁접시로 다시 옮기습니다.
세척을 시작하려면 PBS 의 1 밀리리터를 추가합니다. 알루미늄 호일로 세척 접시를 감싸서 빛으로부터 보호합니다. 접시를 셰이커로 옮기고 부드럽게 흔들어 5분간 흔들어 줍니다.
PBS를 제거하고 전체 세척 과정을 세 번 반복합니다. STORM 이미징 바로 전에 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 이미징 버퍼 1밀리리터를 준비합니다. 커버슬립을 로딩 챔버에 로드합니다.
새로 준비된 이미징 버퍼를 추가하여 시아노균 세포를 씻어내지 않도록 부드럽게 합니다. 그런 다음, 공기 중의 산소와 반응하지 않도록 이미징 버퍼 위에 직사각형 커버슬립을 놓습니다. 카메라, LED 라이트 및 레이저를 켜고 STORM 소프트웨어를 엽니다.
렌즈 위에 반 방울의 침지 오일을 넣습니다. 챔버를 로드하여 객관적인 렌즈가 커버슬립과 접촉하고 있는지 확인합니다. 그리고 750 나노미터 레이저로 신호를 검사한다.
셀과 수탁 마커를 모두 포함하는 샘플 영역을 식별합니다. 그런 다음 샘플 드리프트 보정을 위한 소프트웨어를 시작합니다. 카메라 전자 곱셈 이득이 300밀리초, 노출 시간 30밀리초로 한 개의 와이드 포동 된 이미지를 참조로 획득하십시오.
750나노미터 의 흥분 레이저 강도를 평방 센티미터당 약 4.5km로 늘립니다. 형광이 희소한 깜박임 패턴으로 전환되면 33 hertz에서 10, 000 프레임을 수집하여 하나의 슈퍼 해상도 이미지를 얻습니다. 그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 원시 데이터에서 초해상도 이미지를 재구성합니다.
이 연구에서 STORM은 개별 사진 전환 형광을 관적으로 활성화하여 초해상도 이미징을 달성하는 데 사용됩니다. 모든 불소의 위치가 기록되고 이러한 위치를 기반으로 초해상도 이미지가 구성됩니다. 프로클로로 코커스의 흡수 스펙트럼은 447 및 680 나노미터에서 피크하고 700 나노미터 이상의 최소 흡수를 가지고 있지만, Prochlorococcus MED4 세포는 여전히 STORM 이미징에 필요한 750 나노미터 레이저의 매우 높은 강도에 노출되면 높은 자동 불발성을 방출합니다.
여기에 설명된 포토표백 방법을 30분 동안 사용한 후, 자가형광을 가진 여러 세포가 여전히 검출되더라도 세포의 자동 형광은 감소하는 것으로 보입니다. 광표백을 60분으로 연장하면 대부분의 세포가 자가 불화를 잃게 됩니다. 이러한 결과는 개발된 광표백 방법이 광합성 유기체의 자동 형광을 크게 감소시킬 수 있음을 나타낸다.
포토표백 후 STORM은 세포 분열 단백질인 FtsZ를 세포에서 시각화하는 데 사용됩니다. STORM을 사용하여 FtsZ 링의 상세한 형태가 드러난다. 3D STORM 이미지를 회전하여 4가지 유형의 형태학, 클러스터, 불완전한 링, 완전한 링 및 이중 링이 확인되었습니다.
광표백의 빛 강도와 지속 시간이 다른 유기체에 대해 다를 수 있다는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 개발 후, 이 방법은 단백질 조직과 광합성 세포에서의 잠재적 기능을 자세히 연구하고자 하는 연구자들을 위한 길을 열어줍니다.
