此方法可以帮助回答药物输送领域的关键问题,例如如何向特定的细胞粒细胞提供药物。该技术的主要优点是气体的核转移可以通过光引起。演示程序将是丽娜 · 莫加基和秋叶子 · 阿里萨卡, 我小组的毕业生。
开始准备量子点链接笼分子胶通过合成笼状分子胶链接二苯环环素,如在其他地方更详细地描述。在干DMSO中准备笼状分子胶连接二苯并环环的10毫摩尔库存溶液。然后准备量子点链接笼状分子胶,首先使阿西眼功能化量子点。
为此,在 DMF 中向包含 500 纳米摩尔的量子点的 DMF 溶液中添加 100 微升 125 微摩尔 aseye PEG4 NHS 酯,这些溶液涂有胺功能化挂钩。在室温下搅拌混合物一小时。将所得溶液放在再生的纤维素膜中,对800毫升DMF进行24小时透析。
接下来,将笼状分子胶的库存溶液与DDMF连接50微摩尔,并在透析后溶液中加入200微升。在室温下搅拌混合物三小时。然后使用再生的纤维素膜对800毫升新鲜DMF进行24小时对,分子量切断25000。
24 小时后,用 DMF 将所得溶液稀释至 200 纳米摩尔。在标准培养条件下,在 Eagle 的最小基本介质中维护人类肝细胞癌 HEP3 B 细胞,其中含有 10%FBS。实验前一天,将5000个 HEP3 B 细胞的种子在 200 微升培养基中放入 8 室玻璃滑梯的每个井中。
然后盖住幻灯片,将其放入孵化器 24 小时。第二天取出培养培养剂,用100微升预热PBS冲洗细胞两次。在8室滑轨的每个井中加入200微升的FBS自由介质,其中含有10微摩尔的荧光染色笼状分子胶。
孵育3小时后,取出培养培养剂,用100微升PBS冲洗细胞样品两次。为了可视化,内糖体添加200微升培养培养媒体,其中包含100纳米摩尔的额外红色荧光染料,如LysoTracker Red。孵育产生的细胞样本20分钟。
然后取出培养介质,用100微升PBS冲洗细胞样品两次。之后,将细胞返回培养培养的200微升。为了诱导荧光染色笼状分子胶的核转移,将细胞放在装有365纳米带通滤波器的100瓦Xenon光源下。
将细胞暴露在紫外线下 2 分钟。在此期间,保持控制细胞样本在黑暗中无紫外线照射。玻璃基板的盖子可以取下,以有效进行紫外线照射,但要小心,因为长时间暴露在紫外线下可能会导致细胞死亡。
为了可视化,核在培养基中加入一个微升的霍斯特染色剂。孵育产生的细胞样本10分钟。然后将样品放在共和激光扫描显微镜的舞台上。
记录荧光染色笼状分子胶、LysoTracker Red 和核污渍的显微图。如前所述,种子5000人类肝细胞癌 HEP3 B 细胞进入每个井的 8 井室滑动和培养在标准条件下 24 小时。向细胞样品提供含有荧光染色笼状分子胶的200微升FBS自由培养介质。
孵育产生的细胞样本3小时。然后取出培养介质,用100微升PBS冲洗细胞样品两次。将细胞返回200微升的培养介质。
然后接受样品共和激光扫描显微镜,并记录下所附文本协议中描述的显微图。如前所述,种子5000人肝细胞癌 HEP3 B 细胞进入每个井的 8 井室滑动和培养在标准条件下 24 小时。向细胞样品提供200微升FBS自由培养介质,其中含有10纳米摩尔的量子点链接笼状分子胶。
孵育产生的细胞样本3小时。然后取出介质,用 100 微升 PBS 冲洗细胞样品两次。冲洗细胞后,将它们返回到培养基的200微升。
然后将板放在配备 365 纳米带通滤波器的 100 瓦 Xenon 光源下。将细胞样品暴露在紫外光下 2 分钟,使控制样品保持黑暗。为了可视化,核在培养基中加入1微升的霍赫斯特染色剂。
孵育产生的细胞样本10分钟。然后使用共和激光扫描显微镜对细胞进行成像。在实验前一天,将人类肝细胞癌 HEP3 B 细胞以每井 5000 个细胞种子到 96 井培养板中。
然后用200微升培养的培养剂覆盖细胞,然后将盘子放在培养箱中24小时。第二天取出培养培养剂,用100微升PBS冲洗细胞样品两次。然后加入200微升FBS自由培养介质,含有荧光染色笼状分子胶,浓度在0.1至100微摩尔。
孵育板3小时,然后将板放在UV光源下。将细胞样品暴露在紫外光下 2 分钟,使控制样品保持黑暗。在细胞计数试剂的10微升下紫外线照射到培养基,并孵育产生的细胞样本2小时。
然后使用微孔板读卡器读取样品在 450 纳米的吸收量。在照片辐射之前,用荧光染色笼状分子胶孵育的 HEP3 B 细胞从内部显示双核荧光发射,一个类似的显微图显示 LysoTracker Red 表明荧光染色笼状分子胶在内含体中局部化。因此,在紫外线辐射之前,在细胞核外观察到可分配给荧光染色笼状分子胶的荧光发射。
紫外线辐射后,荧光表明荧光染色笼状分子胶被解开并迁移到细胞质和细胞核。这种荧光染色笼状分子胶的核翻译可以通过近红外光选择性地诱导。在非辐照区域,荧光染色的笼状分子胶没有从内分体中逸出,并且仍然作为双核荧光。
树突笼状分子胶标签也可以将大分子像量子点等大分子进入细胞核。这些结合物可以进入细胞,在紫外线照射2分钟后,量子点的荧光发射可以在细胞核内看到。这一技术得到发展,为基因治疗领域的研究人员探索低副作用治疗铺平了道路。