Diese Methode kann helfen, Schlüsselfrage im Bereich der Medikamentenabgabe zu beantworten, wie ein Medikament an eine bestimmte zelluläre Granular liefern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die nukleare Translokation von Gas durch Licht induziert werden kann. Demonstrieren das Verfahren werden Rina Mogaki und Akio Arisaka die Absolventen meiner Gruppe sein.
Um mit der Vorbereitung des Quantenpunkt-verknüpften Käfig-Molekularklebers zu beginnen, indem man den Käfigmolekülkleber mit Dibenzocyclooctyne synthetisiert, wie an anderer Stelle ausführlicher beschrieben. Bereiten Sie eine 10 Millimolar-Stammlösung des Käfigmolekularklebers verbunden Dibenzocyclooctyne in trockenen DMSO. Dann bereiten Sie den Quantenpunkt verknüpftKäfig molekularen Kleber durch die erste Herstellung aseye funktionalisierten Quantenpunkte.
Um dies zu erreichen, fügen Sie 100 Mikroliter von 125 Mikromolaren-Aseye PEG4 NHS Ester in DMF zu 400 Mikroliter einer DMF-Lösung mit 500 Nanomolar Quantenpunkten hinzu, die mit am in Amin funktionalisierten Peg beschichtet sind. Rühren Sie die Mischung für eine Stunde bei Raumtemperatur. Die resultierende Lösung in eine regenerierte Zellulosemembran geben und 24 Stunden gegen 800 ml DMF dialysieren.
Als nächstes verdünnen Sie die Stammlösung von Käfig-Molekularkleber verbunden Dibenzocyclooctyne zu 50 Mikromolar mit DMF und fügen Sie 200 Mikroliter davon auf die Postdialyselösung. Rühren Sie die Mischung für drei Stunden bei Raumtemperatur. Dialyse die resultierende Mischung für 24 Stunden gegen 800 ml frisches DMF mit einer regenerierten Zellulosemembran mit dem Molekulargewicht abgeschnitten von 25000.
Nach 24 Stunden verdünnen Sie die resultierende Lösung auf 200 Nanomolar mit DMF. Aufrechterhaltung des humanen hepatozellulären Karzinoms HEP3 B-Zellen in Eagles minimalem essentiellem Medium, das 10%FBS unter Standardkulturbedingungen enthält. Einen Tag vor dem Experiment säen 5000 HEP3 B-Zellen in 200 Mikroliter Kulturmedium in jeden Brunnen einer 8 Kammerglasrutsche.
Dann bedecken Sie die Rutsche und legen Sie sie für 24 Stunden in einen Inkubator. Am nächsten Tag entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen zweimal mit 100 Mikrolitern vorgewärmter PBS ab. Zu jedem Brunnen des 8 kammerigen Dias 200 Mikroliter FBS freies Medium mit 10 Mikromolaren eines fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülklebers hinzufügen.
Nach der Inkubation für 3 Stunden entfernen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Zur Visualisierung der Endosomen fügen Sie 200 Mikroliter Kulturmedien hinzu, die 100 Nanomolar eines zusätzlichen roten Fluoreszenzfarbstoffs wie LysoTracker Red enthalten. Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe 20 Minuten lang.
Entfernen Sie dann das Kulturmedium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Danach kehren die Zellen auf 200 Mikroliter des Kulturmediums zurück. Um die kernästhetische Translokation des fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülklebers zu induzieren, platzieren Sie die Zellen unter einer 100 Watt Xenon-Lichtquelle, die mit einem 365-Nanometer-Bandpassfilter ausgestattet ist.
Setzen Sie die Zellen 2 Minuten lang UV-Licht aus. Während dieser Zeit halten Sie die Kontrollzellenprobe ohne UV-Exposition im Dunkeln. Der Deckel der Glassubstrate kann für eine effiziente UV-Exposition abgenommen werden, aber seien Sie vorsichtig, da eine längere Exposition gegenüber UV-Licht zum Zelltod führen kann.
Um die Kerne zu visualisieren, fügen Sie dem Kulturmedium einen Mikroliter Hoeschst-Färbung hinzu. Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe 10 Minuten lang. Legen Sie die Probe dann auf die Bühne eines konfokalen Laserscanmikroskops.
Zeichnen Sie die Mikrographen für den fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülkleber, den LysoTracker Red und den nuklearen Fleck auf. Wie bereits gezeigt, samen 5000 humanes hepatozelluläres Karzinom HEP3 B-Zellen in jedem Brunnen einer 8-Well-Kammer-Rutsche und Kultur unter Standardbedingungen für 24 Stunden. Liefern Sie die Zellproben mit 200 Mikrolitern FBS-freiem Kulturmedium, das den fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülkleber enthält.
Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe für 3 Stunden. Entfernen Sie dann das Kulturmedium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Bringen Sie die Zellen auf 200 Mikroliter Kulturmedium zurück.
Dann unterziehen Sie probe konfokale Laserscanning Mikroskopie und erfassen Sie die Mikrographen, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Wie zuvor gezeigt, Saat 5000 humanhepatozelluläre Karzinom HEP3 B-Zellen in jedem Brunnen einer 8 Brunnenkammer Rutsche und Kultur unter Standardbedingungen für 24 Stunden. Liefern Sie die Zellproben mit 200 Mikrolitern FBS-freiem Kulturmedium, das 10 Nanomolar des Quantenpunkt-verknüpften Käfig-Molekularklebers enthält.
Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe für 3 Stunden. Entfernen Sie dann das Medium und spülen Sie die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS. Nach dem Spülen der Zellen kehren sie auf 200 Mikroliter Kulturmedium zurück.
Legen Sie die Platte dann unter eine 100 Watt Xenon-Lichtquelle, die mit einem 365 Nanometer Bandpassfilter ausgestattet ist. Setzen Sie die Zellprobe 2 Minuten lang UV-Licht aus, um die Kontrollproben im Dunkeln zu halten. Um die Kerne zu visualisieren, fügen Sie 1 Mikroliter Hoechst Fleck zum Kulturmedium hinzu.
Inkubieren Sie die resultierende Zellprobe 10 Minuten lang. Dann stellen Sie die Zellen mit einem konfokalen Laserscanmikroskop ab. Samen Sie das humane hepatozelluläre Karzinom HEP3 B-Zellen am Tag vor dem Experiment mit 5000 Zellen pro Brunnen in eine 96 Brunnenkulturplatte.
Dann bedecken Sie die Zellen mit 200 Mikroliter Kulturmedien und legen Sie die Platte dann 24 Stunden lang in einen Inkubator. Am nächsten Tag das Kulturmedium entfernen und die Zellprobe zweimal mit 100 Mikroliter PBS abspülen. Dann fügen Sie 200 Mikroliter FBS freies Kulturmedium mit dem fluoreszierend gefärbten Käfig molekularen Kleber in Konzentrationen von 0,1 bis 100 Mikromolar.
Inkubieren Sie die Platte für 3 Stunden und legen Sie dann eine Platte unter die UV-Lichtquelle. Setzen Sie die Zellprobe 2 Minuten lang UV-Licht aus, um die Kontrollproben im Dunkeln zu halten. Nach UV-Exposition bei 10 Mikrolitern des Zellzähl-Kits-8-Reagenzes an das Kulturmedium und inkubieren Sie die resultierende Zellprobe für 2 Stunden.
Lesen Sie dann die Absorption der Proben bei 450 Nanometern mit einem Mikroplattenleser. Vor der Photostrahlung zeigt HEP3 B-Zellen, die mit fluoreszierend gefärbtem Käfigmolekülkleber inkubiert werden, eine punktuelle Fluoreszenzemission aus dem Inneren einer analogen Mikrografie, die den LysoTracker Red zeigt, dass fluoreszierend gefärbter Käfigmolekularkleber in den Endosomen lokalisiert wurde. Dementsprechend wurde die fluoreszierend gefärbte Käfigmolekülkleber außerhalb des Zellkerns vor der UV-Strahlung beobachtet.
Nach UV-Strahlung deutet der Fluoreszenz darauf hin, dass fluoreszierend gefärbter Käfigmolekülkleber nicht gekeltert wurde und in das Zytoplasma und den Zellkern migriert wurde. Eine solche kerntechnische Übersetzung des fluoreszierend gefärbten Käfigmolekülklebers kann standortselektiv durch 2-Photonen-Nahinfrarotlicht induziert werden. Der fluoreszierend gefärbte Käfigmolekülkleber in nicht bestrahlten Bereichen entweichte nicht aus den Endosomen und blieb als Punktelfluoreszenz erhalten.
Die dendritischen Käfig-Molekularklebe-Tags können auch makromolekulare Gäste wie Quantenpunkte in den Zellkern liefern. Diese Konjugate können in die Zellen aufgenommen werden und nach UV-Exposition für 2 Minuten kann die Fluoreszenzemission der Quantenpunkte innerhalb des Zellkerns gesehen werden. Nach dieser Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gentherapie, um die Behandlung mit niedrigen Nebenwirkungen zu erforschen.
