Этот метод может помочь ответить на ключевой вопрос в области доставки лекарств, например, как доставить препарат в конкретный клеточно-гранулированный. Основным преимуществом этой техники является то, что ядерная транслокация газа может быть вызвана светом. Демонстрация процедуры будет Рина Могаки и Акио Arisaka аспирантов из моей группы.
Для начала подготовить квантовую точку связаны клетки молекулярного клея путем синтеза в клетке молекулярного клея связаны дибензоциклоктин, как описано более подробно в другом месте. Приготовьте 10-миллиметровый стоковый раствор клетчатого молекулярного клея, связанного дибензоциклоктином в сухом ДМСО. Затем подготовьйте квантовую точку, связанную с молекулярным клеем в клетке, сначала сделав айе функционализированными квантовыми точками.
Для достижения этой цели добавьте 100 микролитров 125 микромолящих aseye PEG4 NHS ester в DMF до 400 микролитров раствора DMF, содержащего 500 наномолярных квантовых точек, которые покрыты функциональной колышек амина. Перемешать смесь в течение одного часа при комнатной температуре. Поместите полученный раствор в регенерированную целлюлозную мембрану и обиализуете его в течение 24 часов против 800 мл DMF.
Далее разбавить фондовый раствор клетчатого молекулярного клея, связанного дибензоциклооктином с 50 микромоляном с DMF и добавить 200 микролитров его в раствор постдиалярия. Перемешать смесь в течение трех часов при комнатной температуре. Затем диализировать полученную смесь в течение 24 часов против 800 мл свежего DMF с помощью регенерирующей целлюлозной мембраны с молекулярной массой отрезанной 25000.
Через 24 часа разбавить полученный раствор до 200 наномоляр с DMF. Поддерживайте гепатоцеллюлярную карциному HEP3 B-клеток в минимальной необходимой среде Орла, содержащей 10%FBS в стандартных культурных условиях. За день до эксперимента семя 5000 HEP3 B-клеток в 200 микролитров культуры среды в каждый колодец 8 камерных стеклянных слайдов.
Затем накройте слайд и поместите его в инкубатор в течение 24 часов. На следующий день удалить культуру среды и промыть клетки дважды с 100 микролитров предварительно разогретых PBS. К каждому колодецу 8 камерного слайда добавляют 200 микролитров свободной среды FBS, содержащей 10 микромолейных флуоресцентно окрашенных клетчатых молекулярных клеев.
После инкубации в течение 3 часов удалить культуру среды и промыть образец клетки в два раза с 100 микролитров PBS. Для визуализации эндосомы добавляют 200 микролитров культурных медиа, содержащих 100 наномоляров дополнительного красного флуоресцентного красителя, такого как LysoTracker Red. Инкубировать полученный образец клетки в течение 20 минут.
Затем удалите культурную среду и дважды промойте образец клетки 100 микролитров PBS. После этого возвращают клетки к 200 микролитров среды культуры. Для индуцирования ядерной транслокации флуоресцентно окрашенного молекулярного клея в клетке поместите клетки под 100-ваттный ксеноновый источник света, оснащенный 365-нанометровым фильтром.
Подвергайте клетки ультрафиолетовому свету в течение 2 минут. В течение этого времени держите образец контрольной ячейки без уф-облучения в темноте. Крышка стеклянных субстратов может быть сняты для эффективного воздействия УФ однако будьте осторожны, как длительное воздействие УФ-излучения может привести к гибели клеток.
Для визуализации ядер добавьте один микролитер пятна Hoeschst в культурную среду. Инкубировать полученный образец клетки в течение 10 минут. Затем поместите образец на стадии конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
Запись микрографов для флуоресцентно окрашенные клетке молекулярного клея, LysoTracker красный, и ядерное пятно. Как было показано ранее, семя 5000 человека гепатоцеллюлярной карциномы HEP3 B-клеток в каждый колодец 8 хорошо камерный слайд и культуры в стандартных условиях в течение 24 часов. Поставка образцов клеток с 200 микролитров FBS свободной среды культуры, содержащей флуоресцентно окрашенные клетке молекулярного клея.
Инкубировать полученный образец клетки в течение 3 часов. Затем удалите культурную среду и дважды промойте образец клетки 100 микролитров PBS. Верните клетки к 200 микролитров среды культуры.
Затем при условии образца конфокального лазерного сканирования микроскопии и записи микрографов, как описано в сопроводительном текстовом протоколе. Как было показано ранее семян 5000 человека гепатоцеллюлярной карциномы HEP3 B-клеток в каждом колодец 8 хорошо камеры слайд и культуры в стандартных условиях в течение 24 часов. Поставка образцов клеток с 200 микролитров FBS свободной среды культуры, содержащей 10 наномоляр квантовой точки связаны клетке молекулярного клея.
Инкубировать полученный образец клетки в течение 3 часов. Затем удалите среду и промыть образец клетки дважды с 100 микролитров PBS. После полоскания клетки возвращают их в 200 микролитров культурной среды.
Затем поместите пластину под 100-ваттный ксенон источник света оснащен 365 нанометровый фильтр bandpass. Подвергайте образец клетки ультрафиолетовому свету в течение 2 минут, сохраняя контрольные образцы в темноте. Для визуализации ядер добавьте 1 микролитер пятна Hoechst в культурную среду.
Инкубировать полученный образец клетки в течение 10 минут. Затем изображение клеток с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа. Семя человека гепатоцеллюлярной карциномы HEP3 B-клеток за день до эксперимента на 5000 клеток на а в 96 хорошо культуры пластины.
Затем накройте клетки 200 микролитров культурных средств массовой информации, а затем поместите пластину в инкубатор в течение 24 часов. На следующий день удалить культуру среды и промыть образец клетки в два раза с 100 микролитров PBS. Затем добавьте 200 микролитров свободной культуры FBS, содержащих флуоресцентно окрашенный молекулярный клей в клетках в концентрациях от 0,1 до 100 микромолей.
Инкубировать пластину в течение 3 часов, а затем поместить пластину под источником УФ-излучения. Подвергайте образец клетки ультрафиолетовому свету в течение 2 минут, сохраняя контрольные образцы в темноте. После воздействия УФ-излучения на 10 микролитров реагента Cell Counting Kit-8 в культурную среду и инкубировать полученный образец клетки в течение 2 часов.
Затем прочитайте поглощение образцов на 450 нанометров с помощью микропластицы читателя. Перед фотоизлучением HEP3 B-клетки, инкубированные флуоресцентно окрашенным молекулярным клеем, демонстрируют панктатное излучение флуоресценции из интерьера, аналогичный микрограф, показывающий LysoTracker Red, указывает на то, что флуоресцентно окрашенный молекулярный клей был локализован в эндосомах. Соответственно, флуоресцентное излучение, присваиваемое флуоресцентно окрашенному молекулярному клею в клетке, наблюдалось вне ядра клетки до УФ-излучения.
После УФ-излучения флуоресцентные предполагает, что флуоресцентно окрашенный в клетку молекулярный клей был незагрязв и мигрировал в цитоплазму и ядро клетки. Такой ядерный перевод флуоресцентно окрашенного молекулярного клея в клетке может быть индуцирован сайтом выборочно 2-фотоном вблизи инфракрасного света. Флуоресцентно окрашенный молекулярный клей в клетке в необлученных областях не избежал эндосом и остался в качестве прокола флуоресценции.
Дендритные клетки молекулярного клея теги могут также доставить макромолекулярных гостей, таких как квантовые точки в ядро клетки. Эти конъюгации могут быть приняты в клетки и после УФ-облучения в течение 2 минут флуоресценции излучения квантовых точек можно увидеть в ядре. После этого развития этот метод проложил путь для исследователей в области генной терапии для изучения низкого лечения побочных эффектов.
