Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na área de entrega de drogas, como como entregar uma droga a um celular-granular específico. A principal vantagem dessa técnica é que a translocação nuclear de gás pode ser induzida pela luz. Demonstrando o procedimento serão Rina Mogaki e Akio Arisaka, os alunos de pós-graduação do meu grupo.
Para começar a preparar o ponto quântico ligou a cola molecular da gaiola sintetizando cola molecular enjaucida ligada à dibenzocyclooctyne como descrito em mais detalhes em outros lugares. Prepare uma solução de estoque de 10 milimilas da cola molecular enjaucada ligada à dibenzocyclooctyne em DMSO seco. Em seguida, prepare o ponto quântico ligado cola molecular enjaucida, primeiro fazendo pontos quânticos funcionalizados aseye.
Para isso, adicione 100 microliters de 125 micromolar aseye PEG4 NHS éster em DMF a 400 microliters de uma solução DMF contendo 500 nanomolar de pontos quânticos que são revestidos com pino funcionalizado de amina. Mexa a mistura por uma hora em temperatura ambiente. Coloque a solução resultante em uma membrana de celulose regenerada e dialise-a por 24 horas contra 800 ml de DMF.
Em seguida, diluir a solução de estoque de cola molecular enjaucada ligada dibenzocyclooctyne a 50 micromolar com DMF e adicionar 200 microliters dele à solução pós dicálise. Mexa a mistura por três horas em temperatura ambiente. Em seguida, dilou a mistura resultante por 24 horas contra 800 ml de DMF fresco usando uma membrana de celulose regenerada com o peso molecular cortado de 25000.
Após 24 horas diluir a solução resultante para 200 nanomolar com DMF. Mantenha o carcinoma hepatocelular humano HEP3 B-cells no meio essencial mínimo da Eagle contendo 10% de FBS em condições de cultura padrão. Um dia antes do experimento, 5000 células B HEP3 em 200 microlitrais de meio de cultura em cada poço de um escorregador de vidro de 8 câmaras.
Em seguida, cubra o slide e coloque-o em uma incubadora por 24 horas. No dia seguinte, remova o meio de cultura e enxágue as células duas vezes com 100 microliters de PBS pré-aquecido. A cada poço do slide de 8 câmaras adicione 200 microliters de meio livre FBS contendo 10 micromolar de uma cola molecular enjauida fluorescente.
Depois de incubar por 3 horas remova o meio de cultura e enxágue a amostra celular duas vezes com 100 microliters de PBS. Para visualizar os endosários adicione 200 microlitros de mídia cultural contendo 100 nanomolar de um corante fluorescente vermelho adicional, como LysoTracker Red. Incubar a amostra celular resultante por 20 minutos.
Em seguida, remova o meio de cultura e enxágue a amostra celular duas vezes com 100 microliters de PBS. Posteriormente, devolva as células a 200 microliters do meio cultural. Para induzir a translocação nuclear da cola molecular enjauida fluorescente coloque as células sob uma fonte de luz de xenônio de 100 watts equipada com um filtro de bandpass de 365 nanômetros.
Exponha as células à luz UV por 2 minutos. Durante este tempo mantenha a amostra da célula de controle sem exposição uv no escuro. A tampa dos substratos de vidro pode ser retirada para uma exposição uv eficiente, no entanto, tome cuidado, pois a exposição prolongada à luz UV pode causar morte celular.
Para visualizar os núcleos adicione um microliter de mancha hoeschst ao meio da cultura. Incubar a amostra celular resultante por 10 minutos. Em seguida, coloque a amostra no estágio de um microscópio de varredura a laser confocal.
Registre os micrografos para a cola molecular enjauida fluorescente, o LysoTracker Red, e a mancha nuclear. Como mostrado anteriormente, sementes 5000 carcinoma hepatocelular humano HEP3 células B em cada poço de um slide de câmara de 8 poços e cultura em condições padrão por 24 horas. Forneça as amostras de células com 200 microliters de meio de cultura livre FBS contendo a cola molecular enjauida fluorescentemente tingida.
Incubar a amostra celular resultante por 3 horas. Em seguida, remova o meio de cultura e enxágue a amostra celular duas vezes com 100 microliters de PBS. Devolva as células para 200 microliters de meio cultural.
Em seguida, sujeito a amostra de microscopia de varredura a laser confocal e registro dos micrografos conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Como mostrado anteriormente, 5000 células hepatocelulares humanas HEP3 B em cada poço de um escorregador de câmara de 8 poços e cultura em condições padrão por 24 horas. Forneça as amostras de células com 200 microlitadores de meio de cultura livre FBS contendo 10 nanomolares da cola molecular enjauida ligada ao ponto quântico.
Incubar a amostra celular resultante por 3 horas. Em seguida, remova o meio e enxágue a amostra celular duas vezes com 100 microliters de PBS. Após enxaguar as células, devolva-as a 200 microliters de meio de cultura.
Em seguida, coloque a placa sob uma fonte de luz de xenônio de 100 watts equipada com um filtro de bandpass de 365 nanômetros. Exponha a amostra celular à luz UV por 2 minutos mantendo as amostras de controle no escuro. Para visualizar os núcleos adicione 1 microliter de mancha hoechst ao meio da cultura.
Incubar a amostra celular resultante por 10 minutos. Em seguida, imagem as células usando um microscópio de varredura a laser confocal. Semente o carcinoma hepatocelular humano HEP3 Células B um dia antes do experimento a 5000 células por poço em uma placa de cultura de 96 poços.
Em seguida, cubra as células com 200 microliters de mídia cultural e, em seguida, coloque a placa em uma incubadora por 24 horas. No dia seguinte, remova o meio de cultura e enxágue a amostra celular duas vezes com 100 microliters de PBS. Em seguida, adicione 200 microliters de cultura livre FBS contendo a cola molecular enjauida fluorescentemente tingida em concentrações que variam de 0,1 a 100 micromolar.
Incubar a placa por 3 horas e, em seguida, colocar uma placa sob a fonte de luz UV. Exponha a amostra celular à luz UV por 2 minutos mantendo as amostras de controle no escuro. Após a exposição uv em 10 microlitres do kit de contagem celular-8 reagente ao meio da cultura e incubar a amostra celular resultante por 2 horas.
Em seguida, leia a absorção das amostras em 450 nanômetros usando um leitor de microplacão. Antes da radiação fotográfica, as células B incubadas com cola molecular enjaulada fluorescente apresentam emissão de fluorescência pontual do interior, um micrografo análogo mostrando o LysoTracker Red indica que a cola molecular enjaulada fluorescente foi localizada nos endósmos. Assim, a emissão de fluorescência atribuída à cola molecular enjauida fluorescente foi observada fora do núcleo celular antes da radiação UV.
Após a radiação UV, a fluorescente sugere que a cola molecular enjauida fluorescente foi descagada e migrou para o citoplasma e o núcleo celular. Tal tradução nuclear da cola molecular enjauida fluorescente pode ser induzida seletivamente por 2 fótons perto da luz infravermelha. A cola molecular enjaulada fluorescente em áreas não irradiadas não escapou dos endósmosos e permaneceu como fluorescência pontual.
As etiquetas de cola molecular enjauladas dendríticas também podem fornecer convidados macromoleculares, como pontos quânticos no núcleo celular. Esses conjugados podem ser levados para as células e após a exposição uv por 2 minutos a emissão de fluorescência dos pontos quânticos pode ser vista dentro do núcleo. Após esse desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores do campo da terapia genética explorarem o tratamento de baixo efeito colateral.
