שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלת מפתח בתחום אספקת תרופות, כגון כיצד לספק תרופה לתרופה ספציפית תאית-פרטנית. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא כי טרנסלוקציה גרעינית של גז יכול להיות המושרה על ידי אור. הפגנה של ההליך תהיה רינה מוגאקי ואקיו אריסאקה, הסטודנטים לתואר שני מהקבוצה שלי.
כדי להתחיל להכין את הנקודה הקוונטית מקושר דבק מולקולרי כלוב על ידי סינתזה דבק מולקולרי בכלוב מקושר dibenzocyclooctyne כמתואר בפירוט רב יותר במקום אחר. הכן פתרון מלאי 10 מילימולרית של דבק מולקולרי בכלוב מקושר dibenzocyclooctyne ב DMSO יבש. לאחר מכן הכינו את הנקודה הקוונטית המקושרת לדבק מולקולרי בכלוב על ידי יצירת נקודות קוונטיות פונקציונליות של aseye.
כדי להשיג זאת להוסיף 100 microliters של 125 micromolar aseye PEG4 NHS אסתר ב DMF כדי 400 microliters של פתרון DMF המכיל 500 nanomolar של נקודות קוונטיות מצופים אמין פונקציונלי יתד. מערבבים את התערובת במשך שעה בטמפרטורת החדר. מניחים את הפתרון וכתוצאה מכך קרום תאית מחדש דיאליזה זה במשך 24 שעות נגד 800 מ"ל של DMF.
לאחר מכן לדלל את פתרון המלאי של דבק מולקולרי בכלוב מקושר dibenzocyclooctyne ל 50 micromolar עם DMF ולהוסיף 200 microliters של אותו לפתרון דיאליזה פוסט. מערבבים את התערובת במשך שלוש שעות בטמפרטורת החדר. ואז להנייד את התערובת וכתוצאה מכך במשך 24 שעות נגד 800 מ"ל של DMF טרי באמצעות קרום תאית מחדש עם המשקל המולקולרי מנותק של 25000.
לאחר 24 שעות לדלל את הפתרון וכתוצאה מכך 200 nanomolar עם DMF. לשמור על קרצינומה hepatocellular אנושי HEP3 B-תאים במדיום החיוני המינימלי של הנשר המכיל 10% FBS בתנאים תרבותיים סטנדרטיים. יום אחד לפני הניסוי זרע 5000 HEP3 B-תאים ב 200 microliters של תרבות בינוני לתוך כל באר של שקופית זכוכית 8 תאים.
לאחר מכן לכסות את השקופית ולה למקם אותו לתוך אינקובטור במשך 24 שעות. למחרת להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את התאים פעמיים עם 100 microliters של PBS מחומם מראש. לכל באר של שקופית 8 תאים להוסיף 200 microliters של המדיום החופשי FBS המכיל 10 micromolar של דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי.
לאחר הדגירה במשך 3 שעות להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. כדי לדמיין את אנדוזומים להוסיף 200 microliters של מדיה תרבות המכיל 100 nanomolar של צבע פלואורסצנטי אדום נוסף כגון LysoTracker אדום. דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 20 דקות.
לאחר מכן להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. לאחר מכן להחזיר את התאים 200 microliters של מדיום התרבות. כדי לגרום טרנסלוקציה גרעינית של דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי למקם את התאים תחת מקור אור קסנון 100 וואט מצויד מסנן 365 ננומטר bandpass.
לחשוף את התאים לאור UV במשך 2 דקות. במהלך תקופה זו לשמור על מדגם תא הבקרה ללא חשיפה UV בחושך. המכסה של מצעי הזכוכית ניתן להוריד לחשיפה יעילה UV עם זאת לנקוט זהירות כמו חשיפה ממושכת לאור UV עלול לגרום למוות של תאים.
כדי לדמיין את הגרעינים להוסיף מיקרוליטר אחד של כתם Hoeschst למדיום התרבות. דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 10 דקות. לאחר מכן מקם את הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל.
תקליטו את המיקרוגרפים של הדבק המולקולרי הצפון-כלוא צבוע בצורה פלואורסצנתית, את האדום של LysoTracker ואת הכתם הגרעיני. כפי שהוצג בעבר, זרע 5000 קרצינומה hepatocellular אנושי HEP3 B-תאים לתוך כל באר של 8 שקופית תא היטב ותרבות בתנאים סטנדרטיים במשך 24 שעות. לספק את דגימות התא עם 200 microliters של מדיום תרבות חינם FBS המכיל את דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי.
הדגירה את דגימת התא וכתוצאה מכך במשך 3 שעות. לאחר מכן להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. להחזיר את התאים 200 microliters של מדיום תרבות.
לאחר מכן בכפוף לדגום מיקרוסקופיה של סריקת לייזר קונפוקל ולתקליט את המיקרוגרפים כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. כפי שהוצג בעבר זרע 5000 קרצינומה hepatocellular אנושי HEP3 B-תאים לתוך כל באר של 8 שקופית תא היטב ותרבות בתנאים סטנדרטיים במשך 24 שעות. לספק את דגימות התא עם 200 microliters של אמצעי תרבות חופשית FBS המכיל 10 nanomolar של נקודה קוונטית מקושר דבק מולקולרי בכלוב.
הדגירה את דגימת התא וכתוצאה מכך במשך 3 שעות. לאחר מכן להסיר את המדיום ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. לאחר שטיפה התאים להחזיר אותם 200 microliters של מדיום תרבות.
לאחר מכן מניחים את הצלחת תחת מקור אור קסנון של 100 וואט המצויד במסנן בנדפס 365 ננומטר. חשוף את דגימת התא לאור UV במשך 2 דקות שמירה על דגימות הבקרה בחושך. כדי לדמיין את הגרעינים להוסיף 1 microliter של כתם Hoechst למדיום התרבות.
דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 10 דקות. לאחר מכן תדמיין את התאים באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקל. זרע את קרצינומה hepatocellular האנושי HEP3 B-תאים יום לפני הניסוי ב 5000 תאים לתוך צלחת תרבות 96 היטב.
לאחר מכן לכסות את התאים עם 200 microliters של מדיה תרבות ולאחר מכן למקם את הצלחת באינקובטור במשך 24 שעות. למחרת להסיר את מדיום התרבות ולשטוף את דגימת התא פעמיים עם 100 microliters של PBS. לאחר מכן הוסיפו 200 מיקרוליטרים של מדיום תרבות חינם FBS המכיל את הדבק המולקולרי הכלוא שננטב בפלורסנט בריכוזים הנעים בין 0.1 ל -100 מיקרומולרים.
דגירה את הצלחת במשך 3 שעות ולאחר מכן מניחים צלחת תחת מקור אור UV. חשוף את דגימת התא לאור UV במשך 2 דקות שמירה על דגימות הבקרה בחושך. בעקבות חשיפה UV ב 10 microliters של ערכת ספירת תאים-8 reagent למדיום התרבות דגירה מדגם התא וכתוצאה מכך במשך 2 שעות.
לאחר מכן לקרוא את ספיגת הדגימות ב 450 ננומטר באמצעות קורא מיקרופלסטיק. לפני קרינת צילום HEP3 B-תאים דגירה עם תערוכות דבק מולקולרי צבועות פלואורסצנטיות תערוכות punctate פליטת פלואורסצנטיות מן הפנים מיקרוגרף אנלוגי מראה את אדום LysoTracker מציין כי דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי היה מקומי אנדוזומים. בהתאם לכך, פליטת הפלואורסצנטיות הניתנת לדבק המולקולרי הצרוב בפלורסנט נצפתה מחוץ לגרעין התא לפני קרינת UV.
לאחר קרינת UV הפלואורסצנט מרמז כי דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי היה uncaged והיגר לתוך הציטופלסמה ואת גרעין התא. תרגום גרעיני כזה של דבק מולקולרי צבוע פלואורסצנטי יכול להיות המושרה באתר באופן סלקטיבי על ידי 2-פוטון ליד אור אינפרא אדום. הדבק המולקולרי הנוהורסנטי באזורים שאינם מוקרנים לא ברח מה אנדוזומים ונשאר פלואורסצנטיות מנוקבת.
תגי הדבק המולקולריים הנדריגטיים בכלוב יכולים גם לספק לאורחים מקרומולקולריים כגון נקודות קוונטיות לתוך גרעין התא. אלה conjugates ניתן לקחת לתוך התאים ולאחר חשיפה UV במשך 2 דקות פליטת פלואורסצנטיות של נקודות קוונטיות ניתן לראות בתוך הגרעין. לאחר התפתחות זו טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים בתחום הריפוי הגנטי לחקור טיפול בתופת לוואי נמוכה.
