Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de l’administration de médicaments, comme la façon de livrer un médicament à un cellulaire-granulaire spécifique. Le principal avantage de cette technique est que la translocation nucléaire du gaz peut être induite par la lumière. Rina Mogaki et Akio Arisaka, les étudiants diplômés de mon groupe, feront la démonstration de la procédure.
Pour commencer à préparer la colle moléculaire de cage liée à point quantique en synthétisant la colle moléculaire en cage liée dibenzocyclooctyne comme décrit plus en détail ailleurs. Préparer une solution de stock de 10 millimolaires de la colle moléculaire en cage liée dibenzocyclooctyne dans le DMSO sec. Préparez ensuite la colle moléculaire en cage liée au point quantique en faisant d’abord des points quantiques fonctionnalisés aseye.
Pour ce faire, ajoutez 100 microlitres de 125 micromolaires aseye PEG4 NHS ester dans DMF à 400 microlitres d’une solution DMF contenant 500 nanomolaires de points quantiques qui sont recouverts d’amine cheville fonctionnalisée. Remuer le mélange pendant une heure à température ambiante. Placez la solution résultante dans une membrane de cellulose régénérée et dyz-la pendant 24 heures contre 800 ml de DMF.
Ensuite, diluer la solution de stock de colle moléculaire en cage liée dibenzocyclooctyne à 50 micromolaire avec DMF et ajouter 200 microlitres de celui-ci à la solution post-dialyse. Remuer le mélange pendant trois heures à température ambiante. Puis dialyser le mélange résultant pendant 24 heures contre 800 ml de DMF frais à l’aide d’une membrane de cellulose régénérée avec le poids moléculaire coupé de 25000.
Après 24 heures diluer la solution résultante à 200 nanomolaires avec DMF. Maintenir le carcinome hepatocellulaire humain HEP3 B-cells dans le milieu essentiel minimal d’Eagle contenant 10%FBS dans des conditions de culture standard. Un jour avant l’expérience semer 5000 cellules B HEP3 dans 200 microlitres de milieu de culture dans chaque puits d’une diapositive en verre à 8 chambelles.
Couvrez ensuite la lame et placez-la dans un incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le milieu de culture et rincez les cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS préchauffé. À chaque puits de la diapositive chambée 8 ajouter 200 microlitres de milieu libre FBS contenant 10 micromolaire d’une colle moléculaire en cage ment colorante fluorescente.
Après avoir couver pendant 3 heures enlever le milieu de culture et rincer l’échantillon cellulaire deux fois avec 100 microlitres de PBS. Pour visualiser les endosomes ajouter 200 microlitres de médias culturels contenant 100 nanomolaires d’un colorant fluorescent rouge supplémentaire comme LysoTracker Red. Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 20 minutes.
Retirez ensuite le milieu de culture et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Ensuite, retournez les cellules à 200 microlitres du milieu de culture. Pour induire la translocation nucléaire de la colle moléculaire en cage à colorant fluorescent placer les cellules sous une source de lumière xénon de 100 watts équipée d’un filtre bandpass de 365 nanomètres.
Exposer les cellules à la lumière UV pendant 2 minutes. Pendant ce temps, gardez l’échantillon de cellule de contrôle sans exposition aux UV dans l’obscurité. Le couvercle des substrats en verre peut être enlevé pour une exposition efficace aux UV mais soyez prudent car une exposition prolongée à la lumière UV peut causer la mort cellulaire.
Pour visualiser les noyaux ajouter un microlitre de tache hoeschst au milieu de la culture. Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 10 minutes. Placez ensuite l’échantillon sur la scène d’un microscope à balayage laser confocal.
Enregistrez les micrographes de la colle moléculaire en cage teint fluorescente, du rouge LysoTracker et de la tache nucléaire. Comme indiqué précédemment, les graines 5000 humains hepatocellulaires carcinome HEP3 B-cellules dans chaque puits d’une diapositive de chambre 8 puits et la culture dans des conditions standard pendant 24 heures. Fournir aux échantillons de cellules 200 microlitres de milieu de culture libre FBS contenant la colle moléculaire en cage ment colorante fluorescente.
Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 3 heures. Retirez ensuite le milieu de culture et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Retourner les cellules à 200 microlitres de milieu de culture.
Ensuite, sous réserve de microscopie à balayage laser confoccal échantillon et enregistrer les micrographes tels que décrits dans le protocole texte d’accompagnement. Comme précédemment montré graine 5000 humains hepatocellulaires carcinome HEP3 B-cellules dans chaque puits d’une diapositive de chambre 8 puits et la culture dans des conditions standard pendant 24 heures. Fournir aux échantillons cellulaires 200 microlitres de milieu de culture libre FBS contenant 10 nanomolaires de la colle moléculaire en cage liée au point quantique.
Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 3 heures. Retirez ensuite le milieu et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Après le rinçage des cellules les retourner à 200 microlitres de milieu de culture.
Placez ensuite la plaque sous une source lumineuse de xénon de 100 watts équipée d’un filtre bandpass de 365 nanomètres. Exposez l’échantillon cellulaire à la lumière UV pendant 2 minutes en gardant les échantillons de contrôle dans l’obscurité. Pour visualiser les noyaux ajouter 1 microlitre de tache hoechst au milieu de la culture.
Incuber l’échantillon de cellules qui en résulte pendant 10 minutes. Puis imagez les cellules à l’aide d’un microscope à balayage laser confocal. Ensemencer le carcinome hepatocellulaire humain HEP3 B-cells la veille de l’expérience à 5000 cellules par puits dans une plaque de culture de puits 96.
Couvrez ensuite les cellules de 200 microlitres de médias culturels, puis placez la plaque dans un incubateur pendant 24 heures. Le lendemain, retirez le milieu de culture et rincez l’échantillon de cellules deux fois avec 100 microlitres de PBS. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu de culture libre FBS contenant la colle moléculaire en cage à colorant fluorescent à des concentrations allant de 0,1 à 100 micromolaires.
Incuber la plaque pendant 3 heures, puis placer une plaque sous la source de lumière UV. Exposez l’échantillon cellulaire à la lumière UV pendant 2 minutes en gardant les échantillons de contrôle dans l’obscurité. Suite à l’exposition aux UV à 10 microlitres du reagent cell counting kit-8 au milieu de culture et incubation de l’échantillon cellulaire résultant pendant 2 heures.
Lisez ensuite l’absorption des échantillons à 450 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaque. Avant le rayonnement photo HEP3 B-cellules incubées avec de la colle moléculaire en cage teint fluorescente montre l’émission de fluorescence punctate de l’intérieur un micrographe analogue montrant le rouge LysoTracker indique que la colle moléculaire en cage teint fluorescentement a été localisée dans les endomètres. Par conséquent, l’émission de fluorescence attribuable à la colle moléculaire en cage ment colorée fluorescente a été observée à l’extérieur du noyau cellulaire avant le rayonnement UV.
Après le rayonnement UV, le fluorescent suggère que la colle moléculaire en cage à colorant fluorescent a été indemne et a migré dans le cytoplasme et le noyau cellulaire. Une telle traduction nucléaire de la colle moléculaire en cage ment colorante fluorescente peut être induite site sélectivement par la lumière infrarouge proche de 2 photons. La colle moléculaire en cage teint fluorescentement dans les secteurs non irradiés n’a pas échappé aux endosomes et est restée comme fluorescence punctate.
Les étiquettes de colle moléculaires en cage dendritiques peuvent également fournir des invités macromoléculaires tels que des points quantiques dans le noyau cellulaire. Ces conjugués peuvent être pris dans les cellules et après exposition aux UV pendant 2 minutes, l’émission de fluorescence des points quantiques peut être observée dans le noyau. Après ce développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans le domaine de la thérapie génique pour explorer le traitement à faible effet secondaire.
