从活细胞中的单端粒表达的癌症细胞克隆的生成, 以可视化含有端粒重复的 rna terra

这种方法可以帮助回答有关端粒的关键问题，如酵母端粒非编码RNATERRA本地化，我可以坚持它是端粒的起源或跨，这种技术的主要优点是，它允许研究人员可视化TERRA分子从活细胞中的单个端粒表达。演示这个程序的将是克劳迪奥·奥斯·佩戈拉尔和妮可·贝廷，两个研究生从我的实验室。根据文本协议开始生长AGS细胞。

然后，当细胞达到50-60%的汇合时，用sgRNA Cas9表达向量和MS2盒。第二天，用含有Neomycin的培养介质取代栽培介质。在此之后，在 96 井板的每个井中加入 10 微升 0.25% 的 Tripsyn。

使用显微镜和标记标记盘中可见的每个克隆的位置。用足够的PBS取代Neomycin培养介质，在克隆上形成一层液体薄膜。使用含有5微升的尝试辛的10微升移液器，慢慢释放尝试素到殖民地。

允许 Trypsin 分离单元格一分钟。用尖端刮掉殖民地，然后吸进尖端。在此之后，将细胞从菌落转移到96井板的井中。

在室温下孵育板五分钟。然后用150微升的选择性介质填充井。接下来，在三个96孔板的每个井中加入100微升明胶。

在室温下孵育板30分钟，用PBS清洗板两次。克隆达到90%汇合后，从板的每个井中吸出介质，用PBS清洗板材。然后在每个井中加入30微升的 Trypsin，并在37摄氏度下孵育板5分钟。

接下来，在每个油井中加入70微升选择性介质。通过上下移液来破坏细胞。将混合物的30微升转移到含有120微升选择性介质的明胶化DNA板的井中。

然后将混合物的30微升转移到含有50微升介质的明化冷冻板。将DNA放在培养箱中，让细胞在37摄氏度下生长，直到达到90%的汇合。在此之后，在冷冻板的每个井中加入80微升的冰冷介质。

用副膜密封板，更换盖子，用铝箔包裹板。然后将冻结板保持在 80 摄氏度。DNA板中的克隆达到90%汇合后，用PBS清洗两次。

然后用50微升的Lysis缓冲液来解化细胞。用副膜盖住盘子，更换盖子，然后用萨兰包装。在此之后，在37摄氏度的温度下孵育板。

第二天，在每一个井中加入100微升的乙醇氯化钠溶液，并允许DNA沉淀6小时或在室温下过夜。然后倒置盘子，用200微升乙醇洗三次，每井70%。在板的每个井中加入20微升的RNase A溶液，并在37摄氏度下孵育板一小时。

之后，使用三个微升的基因组DNA进行PCR扩增，并设置PCR机。根据文本协议，在六个孔板中生长 PCR 正克隆。一旦克隆达到90%的汇合，用PBS清洗细胞，并添加250微升的Lysis缓冲液与蛋白酶K到每个井。

使用细胞刮刀刮取细胞，将 Lysate 转移到 1.5 毫升管中。在37摄氏度下孵育Lysate16小时。在 Lysate 中加入一毫升乙醇，然后剧烈摇晃。

允许克隆在 F-12K 介质中根据文本协议增长。然后，一旦细胞达到70%的汇合，再将克里表达腺病毒加入细胞。感染48小时后，将细胞分成三个10厘米的盘子。

然后培养第三道菜细胞冷冻，和RNA提取。首先，在玻璃底盘中盘制TERRA-MS2克隆和野生型AGS细胞。然后添加多聚氨酯和 MS2-GFP 表达逆转录病毒到介质。

24小时后丢弃含有逆转录病毒的介质，并在细胞中加入不含酚红的新鲜介质。最后，使用倒置显微镜和灵敏的相机图像对具有适当目标和光圈的细胞进行图像。在此协议中，在单个子电信体上创建并成像包含 MS2 序列标记的癌细胞克隆。

使用PCR对抗新霉素克隆进行筛选。阳性克隆在细胞培养中培养，用于基因组DNA提取和南方印迹分析。对PCR和南方印迹分析呈阳性的克隆人感染了CRE-GFP表达腺病毒，以去除MS2盒中存在的Neomycin基因。

一旦新霉素抗药基因的消除得到确认，从克隆中提取的RNA被测试为TERRA-MS2转录本的表达。为了通过共和显微镜在活细胞中可视化TERRA-MS2转录，选定的克隆人感染了表达MS2-GFP融合蛋白的逆转录病毒。TERRA-MS2转录本和端粒通过共生显微镜同时在活细胞中可视化，通过共同表达MS2-GFP融合蛋白和在选定克隆中融合端粒结合蛋白TRF2。

尝试此过程时，必须尽一切努力选择单个克隆，而不是混合克隆。按照这个程序，其他方法，如DNA FISH在染色体传播，可用于可视化的MS2盒在固定细胞的集成。该技术开发后，可为端粒领域的研究人员探索活体细胞中单端粒TERRA分子的细胞定位铺平道路。

不要忘记，使用病毒载体和放射性物质可能是极其不确定的。执行此过程时，应始终采取预防措施，例如穿着实验室外套、手套和使用有机玻璃护罩以尽量减少辐射。