该协议是重要的，因为可用于研究胶质瘤生物标志物的存在的方法，保持肿瘤神经球的3D结构。该协议的主要优点是，神经球的形态与细胞平方法相比，保持细胞平的方法，其中细胞受到压力操纵，并变得扁平。这种方法可以应用于任何其他组织培养系统，其中细胞在3D培养和结构的维护是重要的。
首先，培养肿瘤神经球或NS在T-25烧瓶，直到细胞汇合。在 15 毫升锥形管中选择肿瘤 NS。在 300 Gs 下使用 NS 进行 5 分钟。
在此之后，将颗粒重新悬浮在10%甲醛的一毫升中，并在室温下孵育管子10分钟。在重新悬挂的 NS 中加入五毫升的 HBSS。如前所述，将细胞进行浸渍。将含有颗粒的管子放在冰上。
将洗涤的 NS 颗粒重新悬浮在 500 微升中，其中含有 2% 的热液体 agarose。并混合通过温和的移液或搅拌。将阿加罗斯嵌入的 NS 放在冰上，直到加糖聚合。
然后取出一块加糖，拿着 NS。将一块阿加罗斯放入盒式磁带中进行组织处理。将水浴设置为 42 摄氏度。并小心地将刀片插入显微原子中。
然后将石蜡块放入显微原子中。用一只手向下按控制机器左侧每个部分厚度的操纵杆。将操纵杆按至第二个停止，将微切片设置为 30 微米厚度。
转动粗手轮开始修剪块。样品表面几乎暴露后，将控制厚度的操纵杆设置为 5 或 10 微米。到达样品表面时停止修剪。
将冰盒装满冰块，并有足够的水保护石蜡块，防止其直接接触冰。丢弃旧的微原子刀片，并插入一个新的进行剖切。用纱布擦干石蜡块，放在微原子上。
转动粗手轮开始切截石蜡。然后使用潮湿的画笔将石蜡带转移到 42 摄氏度的水浴。使用钳子的曲线，将钳子放在两个石蜡部分之间，然后轻轻地将截块分开。
使用潮湿的画笔将分离的部分推到带正的粘附显微镜幻灯片上。首先，在60摄氏度的金属架上孵化滑梯20分钟，将石蜡熔化。然后根据文本协议，在室温下在补水列车中通过孵育将幻灯片去分离。
将幻灯片存放在自来水中，以防止非特异性抗体结合。在此之后，在125摄氏度的柠檬酸盐缓冲液中孵育幻灯片30秒，90摄氏度孵化10秒。在用蒸馏水冲洗幻灯片五次之前，让滑梯冷却。
接下来，在室温下将幻灯片孵育为0.3%过氧化氢20分钟。然后，用温和的搅拌将幻灯片洗涤五分钟，在洗涤缓冲液中三次。在将稀释原抗体的加湿室中孵育一夜，温度定在摄氏四度。
在此之后，用轻轻的搅拌将幻灯片洗三次，五分钟。接下来，在室温下将稀释的生物素化二次抗体的幻灯片孵育一小时。用温和的搅拌将滑梯洗涤三次，在洗涤缓冲液中洗五分钟。
然后，在黑暗中的室温下孵育在阿维丁-生物基化马萝卜过氧化物酶复合物中的幻灯片一小时。重复上述清洗。在此之后，用DAB过氧化氢基板品牌孵育幻灯片在室温下两到五分钟。
用自来水冲洗幻灯片，将幻灯片浸入赤氧树脂溶液中，以对抗它们。然后用自来水彻底冲洗滑梯，直到水清澈。根据文本协议使幻灯片脱水。
最后，用二甲苯基安装介质盖住幻灯片，并在室温下将它们干燥在平坦的表面上。在此协议中，NS 是固定的，并嵌入在红糖和石蜡中。然后，他们被染色为特定的胶质瘤生物标志物。
ATRX是一种调解染色质结构的伴郎蛋白，其表达水平较低。Ki67是细胞增殖的生物标志物，在胶质瘤NS中呈阳性。最后，NS对OLI62也呈阳性，这是一种促进寡头细胞分化的转录因子。要记住的最重要的事情是将细胞重新悬浮在温暖的阿加罗斯中，然后再转移到冰中，以确保神经球的均匀分布。
