هذا البروتوكول مهم لأنه يمكن استخدامه لدراسة وجود العلامات الحيوية الورم الدبقي من خلال طريقة تحافظ على بنية ثلاثية الأبعاد من الخلايا العصبية الورم. الميزة الرئيسية لهذا البروتوكول هو أن يتم الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا العصبية مقارنة مع طريقة cytospin التي تتعرض الخلايا للتلاعب المجهدة وتصبح بالارض. يمكن تطبيق هذه الطريقة على أي أنظمة أخرى لثقافة الأنسجة التي يتم فيها زراعة الخلايا في 3D والحفاظ على الهيكل مهم.
للبدء، الخلايا العصبية أو ن ن في قارورة T-25 حتى يتم التقاء الخلايا. انتخاب الورم NS في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر. (إمبيليت) في 300 جي لمدة خمس دقائق
بعد هذا، إعادة تعليق بيليه في ملليلتر واحد من 10٪ formalin واحتضان الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة. إضافة خمسة ملليلتر من HBSS إلى NS إعادة تعليق. impellet الخلايا كما وصف سابقا. وضع أنبوب يحتوي على بيليه على الجليد.
إعادة تعليق بيليه NS غسلها في 500 ميكرولترات من اثنين في المئة من أكاروز السائل الدافئ. ويخلط بواسطة الأنابيب لطيف أو التحريك. ضع agarose جزءا لا يتجزأ من NS على الجليد حتى أغاروز البلمرة.
ثم إزالة قطعة من agarose ، وعقد NS. ضع قطعة من agarose في كاسيت لتجهيز الأنسجة. تعيين حمام مائي إلى 42 درجة مئوية. و ادرج الشفرة بعناية في الميكراتوم.
ثم ضع كتلة البارافين في المايكروتوم. بيد واحدة، اضغط لأسفل على ذراع يتحكم في سمك كل قسم يقع على الجانب الأيسر من الجهاز. اضغط على ذراع إلى المحطة الثانية لتعيين microtome إلى سمك ميكرومتر 30.
بدوره عجلة اليد الخشنة لبدء تقليم كتلة. بمجرد تعرض سطح العينة تقريبًا ، قم بضبط الرافعة التي تتحكم في سمكها إلى خمسة أو 10 ميكرومترات. توقف عن التشذيب عند الوصول إلى سطح العينة.
ملء مربع الثلج مع الجليد والمياه فقط ما يكفي لحماية كتلة البارافين من لمس الجليد مباشرة. تجاهل شفرة microtome القديمة وإدراج واحدة جديدة للقطع. جفف كتلة البارافين بالشاش ووضعها على المايكروتوم.
بدوره عجلة اليد الخشنة لبدء قسمة البارافين. ثم استخدام فرشاة الطلاء رطبة لنقل الشريط البارافين إلى 42 درجة مئوية حمام الماء. باستخدام منحنى من ملقط، ووضع ملقط في ما بين قسمين البارافين ودفع أقسام بعيدا بلطف.
استخدام فرشاة الطلاء رطبة لدفع أقسام فصل على الشرائح المجهر التصاق مشحونة إيجابيا. أولاً، إذابة البارافين عن طريق احتضان الشرائح في رف معدني عند 60 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ثم إلغاء صبغ الشرائح عن طريق الحضانة في قطار إعادة الترطيب في درجة حرارة الغرفة وفقا لبروتوكول النص.
تخزين الشرائح في ماء الصنبور لمنع ربط الأجسام المضادة غير محددة. بعد ذلك، احتضان الشرائح في العازلة سيترات في 125 درجة مئوية لمدة 30 ثانية و 90 درجة مئوية لمدة 10 ثوان. السماح للشرائح لتبرد قبل شطف لهم خمس مرات مع الماء المقطر.
بعد ذلك، احتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في بيروكسيد الهيدروجين 0.3٪ لمدة 20 دقيقة. ثم، غسل الشرائح لمدة خمس دقائق، ثلاث مرات في عازلة الغسيل مع التحريض لطيف. احتضان الشرائح بين عشية وضحاها في غرفة مرطبة تعيين إلى أربع درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المخففة.
بعد ذلك، اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق مع هياج لطيف. بعد ذلك ، احتضان الشرائح في الأجسام المضادة الثانوية المخففة biotinylated في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة. اغسل الشرائح ثلاث مرات لمدة خمس دقائق في عازلة الغسيل مع التحريض لطيف.
ثم، احتضان الشرائح في avidin-biotinylated مجمع بيروكسيديز الفجل في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة. كرر الغسيل كما سبق وصفه. بعد ذلك، احتضان الشرائح مع علامات الركيزة بيروكسيد الهيدروجين DAB لمدة دقيقتين إلى خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.
شطف الشرائح مع مياه الصنبور وتراجع الشرائح في حل الهماوكسيلين لمضادة لهم. ثم شطف الشرائح جيدا في ماء الصنبور حتى المياه يعمل واضحة. يجفف الشرائح وفقًا لبروتوكول النص.
وأخيراً، تُغطّى الشرائح بمتوسط متصاعد قائم على الزيلين، وتسمح لها بالجفاف على سطح مستوٍ في درجة حرارة الغرفة. في هذا البروتوكول، يتم إصلاح NS وجزءا لا يتجزأ في agarose والبارافين. ثم أنها ملطخة للعلامات الحيوية الورم الدبقي محددة.
مستوى التعبير من ATRX، وهو بروتين مرافق يتوسط بنية الكروماتين، منخفض. Ki67، وهو علامة بيولوجية لانتشار الخلايا، هو إيجابي في NS الورم الدبقي. وأخيراً، فإن NS هي أيضا إيجابية لOLIG2، وهو عامل النسخ الذي يتوسط التمايز oligodendrocyte. أهم شيء يجب تذكره هو إعادة تعليق الخلايا بشكل جيد في الأذانروز الدافئ قبل الانتقال إلى الجليد ، لضمان توزيع متكافئ للغلاف العصبية.
