Tümör nörosferlerinin 3Boyutlu yapısını koruyan bir yöntemle glioma biyomarkervarlığını incelemek için kullanılabilir, çünkü bu protokol önemlidir. Bu protokolün en büyük avantajı, hücrelerin stresli manipülasyona maruz kaldığı ve düzleştirildiği sitospin yöntemine göre nörosferlerin morfolojisinin korunmasıdır. Bu yöntem, hücrelerin 3Boyutlu olarak kültürlendiği diğer doku kültürü sistemlerine uygulanabilir ve yapının bakımı önemlidir.
Başlamak için, bir T-25 şişesinde kültür tümör nörosferler veya NS hücreleri confluent kadar. 15 mililitrelik konik tüpte tümör NS'i seçin. NS'i 300 Gs'ye beş dakika lığına itin.
Bundan sonra, peletin mililitresini %10 formalin olarak yeniden askıya alın ve tüpü oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Yeniden askıya alınan NS'ye beş mililitre HBSS ekleyin. Daha önce açıklandığı gibi hücreleri impellet. Pelet içeren tüpü buz üzerine yerleştirin.
Yıkanmış NS peletini %2'lik ılık sıvı agarose'un 500 mikrolitresinde yeniden askıya alın. Ve nazik bir pipetleme veya karıştırarak karıştırın. Agarose polimerize olana kadar buz üzerinde agarose gömülü NS yerleştirin.
Sonra ns tutarak, agarose parçası çıkarın. Doku işleme için bir kaset içine agarose parçası yerleştirin. 42 santigrat dereceye kadar bir su banyosu ayarlayın. Ve bıçağı dikkatlice mikrotome takın.
Sonra parafin bloğunu mikrotome yerleştirin. Bir elinizle makinenin sol tarafında bulunan her bölümün kalınlığını kontrol eden kolu bastırın. Mikrotomu 30 mikrometre kalınlığa ayarlamak için kolu ikinci durağa bastırın.
Bloğu kesmeye başlamak için kaba el tekerleğine dönün. Numunenin yüzeyi neredeyse açığa çıktıktan sonra kalınlığı kontrol eden kolu beş veya 10 mikrometreye ayarlayın. Numunenin yüzeyine ulaşıldığında kesmeyi durdurun.
Bir buz kutusunu buzla doldurun ve parafin bloğunu doğrudan buza dokunmaktan koruyacak kadar su doldurun. Eski mikrotom bıçağını atın ve kesit için yeni bir tane yerleştirin. Parafin bloğunu gazlı bezle kurulayın ve mikrotome yerleştirin.
Parafin kesitbaşlamak için kaba el tekerleği açın. Sonra 42 derece Santigrat su banyosu parafin şerit aktarmak için nemli bir boya fırçası kullanın. Forceps eğrisi kullanarak, iki parafin bölümleri arasında forceps yerleştirin ve yavaşça ayrı bölümleri itin.
Ayrılmış bölümleri pozitif yüklü yapışma mikroskop slaytlarına itmek için nemli boya fırçasını kullanın. İlk olarak, 20 dakika boyunca 60 santigrat derece bir metal raf slaytlar kuluçka parafin eritin. Daha sonra metin protokolüne göre oda sıcaklığında bir re-hidrasyon treninde kuluçka yoluyla slaytlar deparaffinize.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için slaytları musluk suyunda saklayın. Bundan sonra, 125 santigrat derece santigrat 30 saniye ve 10 saniye için 90 derece santigrat slaytlar kuluçka. Damıtılmış su ile beş kez durulama önce slaytlar soğumasını bekleyin.
Daha sonra, 20 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.3 hidrojen peroksit slaytlar kuluçka. Daha sonra, hafif ajitasyon ile tampon yıkama üç kez, beş dakika slaytlar yıkayın. Seyreltilmiş primer antikor ile dört santigrat dereceye ayarlanmış nemli bir odada bir gecede slaytlar kuluçka.
Bundan sonra, hafif ajitasyon ile beş dakika boyunca slaytlar üç kez yıkayın. Daha sonra, bir saat boyunca oda sıcaklığında seyreltilmiş biyotinylated ikincil antikor slaytlar kuluçka. Hafif ajitasyon ile tampon yıkama beş dakika slaytlar üç kez yıkayın.
Daha sonra, bir saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında avidin-biyotinylated horseradish peroksidaz kompleksinde slaytlar kuluçka. Daha önce açıklandığı gibi yıkamayı tekrarlayın. Bundan sonra, oda sıcaklığında iki ila beş dakika DAB hidrojen peroksit substrat markaları ile slaytlar inkübasyon.
Musluk suyu ile slaytlar durulayın ve onları karşı leke için hematoksin çözeltisi slaytlar daldırma. Daha sonra su temizlenene kadar kaydırakları musluk suyunda iyice durulayın. Slaytları metin protokolüne göre susuz kalın.
Son olarak, ksilen bazlı montaj ortamı ile slaytlar coverslip ve oda sıcaklığında düz bir yüzeyüzerinde kurumasını bekleyin. Bu protokolde NS sabit ve agarose ve parafin gömülüdür. Ve sonra belirli glioma biyobelirteçleri için lekeli.
Kromatin yapısına aracılık eden bir şaperon proteini olan ATRX'in ifade düzeyi düşüktür. Ki67, hücre proliferasyonu bir biyomarker, glioma NS pozitif. Son olarak, NS de OLIG2, oligodendrocyte farklılaşma aracılık bir transkripsiyon faktörü için pozitif. Hatırlanması gereken en önemli şey, nörosferlerin eşit bir şekilde dağıtılmasını sağlamak için, buza geçmeden önce sıcak agarose'daki hücreleri yeniden askıya almaktır.
