פרוטוקול זה הוא משמעותי כי ניתן להשתמש כדי ללמוד את נוכחותו של סמן ביולוגי glioma על ידי שיטה המשמרת את המבנה 3D של נוירוספרות הגידול. היתרון העיקרי של פרוטוקול זה הוא כי המורפולוגיה של נוירוספרות נשמר בהשוואה לשיטת cytospin שבו תאים נתונים מניפולציה מלחיצה ולהיות שטוח. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכות אחרות תרבת רקמות שבו תאים מתורבתים 3D ותחזוקה של המבנה חשוב.
כדי להתחיל, נוירוספרות גידול תרבות או NS בבקבוק T-25 עד התאים הם confluent. בחר את הגידול NS בצינור חרוט 15 מיליליטר. אל תדהים את האן.אן.איי ב-300 אלף למשך חמש דקות.
לאחר מכן, להשעות מחדש את גלולה במיליליטר אחד של 10% פורמלין ו דגירה הצינור בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. הוסף חמישה מיליליטר של HBSS ל- NS המושעה מחדש. אל תדהים את התאים כפי שתואר קודם לכן. מניחים את הצינור המכיל את גלולה על קרח.
להשעות מחדש את גלולת NS שטף ב 500 microliters של שני אחוזים נוזל חם אגרוז. ומערבבים על ידי צינור עדין או ערבוב. מניחים את NS מוטבע אגרוז על קרח עד הפולימרים אגרוז.
ואז להסיר את פיסת אגרוז, מחזיק את NS. מניחים את חתיכת אגווז לתוך קלטת לעיבוד רקמות. קבעו אמבט מים ל-42 מעלות צלזיוס. ולהכניס בזהירות את הלהב לתוך המיקרוטום.
ואז למקם את בלוק הפרפין לתוך המיקרוטום. ביד אחת, לחץ על הידית השולטת בעובי של כל קטע הממוקם בצד שמאל של המכונה. לחץ על הידית לתחנה השנייה כדי להגדיר את המיקרוטום לעובי של 30 מיקרומטר.
סובב את גלגל היד גס כדי להתחיל לקצץ את הבלוק. לאחר ש פני השטח של המדגם כמעט נחשפים, הגדר את הידית השולטת בעובי לחמישה או עשרה מיקרומטרים. הפסק לחתוך כאשר מגיעים לפני השטח של הדגימה.
מלאו קופסת קרח בקרח ומספיק מים כדי להגן על גוש הפרפין מלגעת ישירות בקרח. השלך את להב המיקרוטום הישן והכנס להב חדש לקטע. יבש את בלוק הפרפין עם גזה והצב אותו על המיקרוטום.
סובב את גלגל היד גס כדי להתחיל חתך את הפרפין. לאחר מכן השתמשו במברשת צבע לחה כדי להעביר את סרט הפרפין לאמבט המים של 42 מעלות צלזיוס. בעזרת עקומת המדחפים, מניחים את המדפים בין שני חלקי פרפין ומפרקים את החלקים בעדינות.
השתמש במברשת הצבע הלחה כדי לדחוף את המקטעים המופרדים לשקופיות מיקרוסקופ הידבקות טעונות באופן חיובי. ראשית, ממיסים את הפרפין על ידי דגירה של המגלשות במתלה מתכת ב-60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. ואז deparaffinize את השקופיות באמצעות דגירה ברכבת הידרציה מחדש בטמפרטורת החדר על פי פרוטוקול הטקסט.
אחסן את המגלשות במי ברז כדי למנוע כריכת נוגדנים לא ספציפית. לאחר מכן, הדגירה את השקופיות במאגר ציטראט ב 125 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ו 90 מעלות צלזיוס במשך 10 שניות. אפשר למגלשות להתקרר לפני שטיפתן חמש פעמים במים מזוקקים.
לאחר מכן, הדגירה את השקופיות בטמפרטורת החדר ב 0.3% מי חמצן במשך 20 דקות. לאחר מכן, לשטוף את השקופיות במשך חמש דקות, שלוש פעמים במאגר כביסה עם תסיסה עדינה. הדגירה את המגלשות לילה בתא לח להגדיר ארבע מעלות צלזיוס עם נוגדן ראשוני מדולל.
לאחר מכן, לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות עם תסיסה עדינה. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות בנוגדן משני ביוטינילציה מדולל בטמפרטורת החדר במשך שעה. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים במשך חמש דקות במאגר כביסה עם תסיסה עדינה.
לאחר מכן, הדגירה את המגלשות במתחם פרוקסידזה חזרת avidin-biotinylated בטמפרטורת החדר בחושך במשך שעה. חזור על הכביסה כמתואר לעיל. לאחר מכן, הדגירה את המגלשות עם DAB מי חמצן מצע מותגים במשך שתיים עד חמש דקות בטמפרטורת החדר.
יש לשטוף את המגלשות במי ברז ולטבול את המגלשות בתקשת המטוקסילין כדי לנטרל אותן. לאחר מכן שוטפים את המגלשות ביסודיות במי ברז עד שהמים מתבהרים. ייבש את השקופיות בהתאם לפרוטוקול הטקסט.
לבסוף, מכסה את השקופיות עם מדיום הרכבה מבוסס קסילן ולאפשר להם להתייבש על משטח שטוח בטמפרטורת החדר. בפרוטוקול זה, NS קבועים ומוטבעים אגרוז ופרפין. ואז הם מוכתמים לסמנים ביולוגיים ספציפיים של גליומה.
רמת הביטוי של ATRX, חלבון מלווה התיווך מבנה הכרומטין, נמוכה. Ki67, סמן ביולוגי של התפשטות תאים, הוא חיובי ב NS גליומה. לבסוף, NS הם גם חיוביים עבור OLIG2, גורם שעתוק המתווך התמורות oligodendrocyte. הדבר החשוב ביותר לזכור הוא להשעות מחדש את התאים היטב ב agarose חם לפני המעבר לקרח, כדי להבטיח הפצה שווה של נוירוספרות.
