使用该协议，可以从哺乳动物细胞中有效地纯化给定蛋白质的泛素化形式，从而促进泛素化在调节蛋白质功能中的作用的研究。与体外纯化相比，哺乳动物细胞中泛素化蛋白的纯化保留了靶蛋白在更多放射条件下的泛素连接模式。首先在三个 15 毫升离心管中加入 1.5 毫升还原血清培养基。
向每个试管中加入准备转染的质粒DNA，并添加0.2微克绿色荧光蛋白质粒以监测转染效率。在另一个离心管中将78微升脂质体转染试剂加入4.5毫升还原血清培养基中以稀释脂质体。通过轻弹试管充分混合，然后在室温下静置五分钟。
将1.5毫升稀释的脂质体溶液加入含有1.5毫升稀释DNA溶液的每个试管中。充分混合并在室温下将质粒与脂质体交联至少20分钟。从培养皿中丢弃原始培养基，并在每个培养皿中加入 9 毫升还原的血清培养基。
加入三毫升脂质体DNA混合物，通过轻轻来回摇动板三次，然后左右摇动三次来混合溶液，以使混合物均匀分布在板上。在加湿的培养箱中用5%二氧化碳在37摄氏度下培养细胞。四至六小时后更换培养基，并继续培养细胞24至36小时。
24至36小时后，用终浓度为10微摩尔的MG132处理细胞4至6小时。丢弃培养基并用冰冷的PBS洗涤细胞两次。在盘子中加入一毫升PBS。
用干净的刮刀刮除细胞，并将细胞悬液转移到微量离心管中。以700 G离心五分钟以收集细胞沉淀。向每个管中的细胞中加入800微升冰冷的FLAG裂解缓冲液，并补充有蛋白酶抑制剂混合物。
使用涡旋振荡器或移液器枪混合细胞，然后将混合物在4摄氏度的旋转器上孵育30分钟。在冰上对混合物进行超声处理，每个脉冲持续一秒钟，并将混合物置于5到10个短暂的脉冲中。将混合物在 40 RPM 的旋转器上以 4 摄氏度孵育 30 分钟。
然后将超声样品在8， 000 G下在4摄氏度下离心20至30分钟。将上清液转移到新的微量离心管中。分装80微升细胞提取物，并与20微升5X SDS上样缓冲液混合。
将样品在 98 摄氏度下煮沸五分钟。在冰上冷却两分钟，并在零下20摄氏度下储存直至使用。使用这些样品作为监测蛋白表达的输入组。
接下来，将 30 微升抗 FLAG M2 抗体偶联珠添加到剩余的细胞提取物中，并在 4 摄氏度的旋转器上孵育至少四个小时或过夜。在 1， 500 G 下在 4 摄氏度下离心两分钟以收集珠子。向珠子中加入一毫升冰冷的FLAG裂解缓冲液，并通过倒置试管数次进行混合。
重复此步骤四到六次，然后将40微升FLAG肽以终浓度为每微升200纳克加入珠子中。如前所述，在旋转器上孵育两个小时，然后在相同的温度下离心。将上清液转移到新的微量离心管中，并加入10微升5X SDS上样缓冲液。
将混合物在 98 摄氏度下煮沸五分钟，然后在冰上冷却两分钟。将一毫升冰冷的PBS加入细胞沉淀中并混合均匀。将100微升细胞悬液等分到微量离心管中作为输入样品，并在4摄氏度下以700G离心5分钟以收集细胞沉淀。
向输入样品中加入80微升FLAG裂解缓冲液，并使用涡旋振荡器混合细胞，如前所述。在冰上裂解细胞一小时，然后再次离心20至30分钟。离心后，将80微升上清液等分到新的微量离心管中，并向上清液中加入20微升5X SDS上样缓冲液。
将混合物在 98 摄氏度下煮沸 5 到 10 分钟，然后在冰上冷却两分钟。将剩余的900微升细胞悬液在700G下在4摄氏度下离心5分钟以收集细胞沉淀。向细胞沉淀中加入一毫升泛素缓冲液1，并通过上下移液数次混合以使细胞均匀分布。
将细胞裂解物在冰上进行10至20轮超声处理，直到溶液不再粘稠，然后离心溶液。将上清液转移到新的微量离心管中，并向上清液中加入30微升带镍树脂。在旋转器上以 15 RPM 孵育四小时或在室温下孵育过夜，然后离心两分钟。
离心后，收集珠子并向其中加入一毫升泛素缓冲液1。如前所示，在摇床中旋转孵育10分钟，然后再次以1， 500 G离心2分钟。向磁珠中加入一毫升泛素缓冲液2，进行孵育，然后离心，如前所示，收集珠子。
重复此步骤一次。接下来，向珠子中加入一毫升PBS，并按照相同的孵育和离心程序收集珠子。再次重复此步骤。
通过在室温下将珠子与40微升咪唑以终浓度为0.5摩尔孵育一小时来洗脱结合的蛋白质。孵育后，再次以1， 500 G离心两分钟。将上清液转移到干净的微量离心管中，并加入10微升5X SDS上样缓冲液。
将溶液在 98 摄氏度下煮沸五分钟，然后在冰上冷却两分钟。通过SDS-PAGE分离样品，然后通过蛋白质印迹将其转移到硝酸纤维素膜上，以使用相应的抗体检测靶蛋白。启动化学发光成像系统以检测蛋白质免疫印迹的信号。
将硝酸纤维素膜面朝上放入相机暗箱中。使用移液器枪将底物溶液均匀地编码在膜上。最后，选择自动曝光程序以捕获化学发光信号并手动调整曝光时间，直到获得理想信号。
总p53蛋白，包括泛素化的p53，在非变性条件下用来自H1299细胞的FLAG M2磁珠免疫沉淀。洗脱液用抗p53和抗血凝素或抗p53和单克隆抗体进行蛋白质印迹。在这里，粗细胞提取物或输入物用抗p53和抗MDM2单克隆抗体进行蛋白质印迹。
当MDM2在这些细胞中异位表达时，来自泛素化p53蛋白的信号显着增加，该信号从低分子量到高分子量显示为拖尾条带。这一结果表明，泛素化的p53蛋白已从细胞中有效纯化。接下来，在变性条件下裂解细胞。
用带镍树脂拉下总细胞泛素化蛋白，然后用抗p53和抗血凝素单克隆抗体进行蛋白质印迹。使用抗p53抗体和抗血凝素抗体检测泛素化的p53蛋白。在粗细胞提取物或输入物中用抗p53和抗MDM2单克隆抗体进行蛋白质印迹。
结果表明，在这些细胞中过表达MDM2后，总泛素化蛋白水平保持不变，但泛素化的p53蛋白水平显着增加。这表明含有泛素化p53的总泛素蛋白在变性条件下有效地从细胞裂解物中拉落。尝试此过程时，请记住在细胞采集前用MG132处理细胞，并在冰上对细胞进行适当的超声处理，以纯化泛素化的蛋白质。
