增殖性糖尿病视网膜病变纤维血管并发症的体外组织培养模型

糖尿病视网膜病变是糖尿病最常见的微血管并发症。该方法有助于回答期末疾病增殖性糖尿病视网膜病变病理生理学的关键问题。该技术可解构原生三维组织景观，并研究具有直接临床意义的活体患者材料中的组织病理生理学。有关手术和解剖中使用仪器的详细信息，请参阅文本协议。首先，将从接受转结微切口玻璃化手术的人体受试者中切除的纤维血管组织放在含有无菌PBS的细胞培养皿中。使用直立解剖立体显微镜，将纤维血管组织切成大约一平方毫米的碎片。将组织淹没在PBS中，用微解剖钳将组织放在位上。在组织中进行清晰的切割，用无菌的手术刀小心，以避免撕裂纤维血管组织。将每一块单独的组织放入含有一毫升无菌 PBS 的 12 井细胞培养板的井中。首先，在室温下准备25微升的纤维蛋白原溶液等分。将一块纤维血管组织放在24井板的井的中心，并去除任何多余的PBS。接下来，将 25 微升 TA 溶液添加到其中一个准备好的纤维蛋白原等分中。并使用另一个设置为 50 微升的移液器通过移液混合。将混合物分配到纤维血管组织和移液器上，以确保组织片包含在液滴中。纤维蛋白原形成的时间对外活培养的三维性至关重要，在协议中描述的空滴前组织嵌入中进行测试。在细胞培养孵化器中孵育板。30 至 60 分钟后倾斜板，检查纤维蛋白凝胶是否完全形成。接下来，用外活培养培养介质与阿普罗汀补充覆盖纤维血管组织纤维蛋白凝胶。在此之后，将培养板返回到所需时间段的细胞培养箱。首先，将外体培养基替换为每井一毫升的甲状甲醛溶液，以修复培养物。一小时后，用三个五分钟的PBS洗涤冲洗凝胶。接下来，用每井两毫升的阿齐德钠溶液代替PBS洗涤液。将固定凝胶存放在四摄氏度下。使用不锈钢方形边缘铲，小心地将液滴从板中提起，从边缘开始，然后提起液滴的中心。使用圆边铲将液滴转移到含有一毫升 PBS 的 12 孔板的单个孔中。在此之后，将板倾斜在支撑上，用一毫升冰冷的丙酮甲醇溶液将液滴固定一分钟。然后，用三到五两毫升的PBS洗涤冲洗。离心堵塞溶液15分钟，以清除任何碎屑。然后，将板倾斜在支撑上，在室温下将液滴孵育为 500 微升的阻消溶液中，两小时。根据文本协议准备原抗体混合物。然后使用圆边铲将液滴转移到圆底 96 井板。在4摄氏度下，在30微升原抗体混合物中孵育液滴。第二天，将液滴转移到一个12井板，每井含有两毫升的洗涤液。用三个五分钟的洗涤冲洗液滴。然后，用9个30分钟的洗涤液滴清洗。第二天，用PBS冲洗液滴三次。根据文本协议准备适当的氟磷结合二级抗体混合物。如先前证明，将液滴转移到圆底96井板中，并在室温下用30微升二次抗体混合物孵育板4小时，防止光线。四小时后，将液滴转移到一个12井板，每井含有两毫升的洗涤液。首先，用三个五分钟的洗涤冲洗液滴。然后，用四个30分钟的洗涤液滴清洗液滴。第二天，用洗涤溶液冲洗液滴5次，用30分钟清洗30分钟。第二天，将液滴转移到圆底96井板，如前所述。在室温下用霍赫斯特核污渍对液滴进行30分钟的反色。将液滴转移到每井含有两毫升 PBS 的 12 井板中，然后用 PBS 冲洗三次。接下来，沿方形盖玻璃的边缘应用一层狭窄的快速硬化安装介质，让其干燥一分钟。然后，将液滴浸入含有去压水的12井板的井中冲洗液滴。将液滴转移到显微镜幻灯片上。接下来，在液滴上分配 15 微升非硬化防褪色安装介质。将盖玻璃轻轻放在液滴上，安装介质朝向滑轨，让其稳定下来。让滑梯在室温下干燥两小时，并在夜间存放在四摄氏度。最后，使用直立的荧光显微镜在20倍或40倍的镜面上使用配备光学剖面功能的幻灯片进行成像。在该协议纤维血管组织被准备和成像。代表性数据表明，PDR外体培养物会诱发CD-31阳性内皮和血管保存的萌芽，以回应维格法。相反，TGF