増殖糖尿病網膜症における線合併症の体外培養モデル

糖尿病性網膜症は、糖尿病の最も一般的な微小血管合併症である。この方法は、末期疾患増殖性糖尿病性網膜症の病態生理に関する重要な質問に答える助けとなる。この技術は、ネイティブ3次元組織景観の解体と直接臨床的関連性を有する生きた患者材料における組織病態生理学の調査を可能にする。手術と解剖で使用される計器の詳細については、テキストプロトコルを参照してください。まず、滅菌PBSを含む細胞培養皿に結膜微小括約手術を受けるヒト被験者から切除された線維血管組織を配置する。直立解剖ステレオ顕微鏡を用いて、線維血管組織を約1平方ミリメートルに切断する。PBSに組織を沈め、マイクロ解剖ピンセットで組織を所定の位置に保持します。線維血管組織を引き裂かないように注意して、滅菌メスで組織に明確なカットを行います。滅菌PBSの1ミリリットルを含む12ウェル細胞培養プレートのウェルに組織の個々の部分を置きます。まず、フィブリノーゲン溶液の25マイクロリットルのアリコートを室温で調製する。24ウェルプレートのウェルの中心に線維血管組織の1片を置き、余分なPBSを取り除きます。次に、25マイクロリットルのTA溶液を、調製したフィブリノーゲンアリコートの1つに添加する。そして、ピペットによって混合50マイクロリットルに設定された別のピペットを使用しています。線維血管組織の部分に混合物を分配し、ピペットを上下に分配し、組織片が液滴内に含まれていることを保証します。また、エキビボ培養の3次元性に対して重要なフィブリノーゲン形成の時間は、プロトコルに記載されているように、空の液滴前組織埋め込みで試験される。細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートする。30〜60分後にプレートを傾け、フィブリンゲルが完全に形成されていることを確認します。次に、線維血管組織フィブリンゲルをアプロチニンを添加した元生体培養培地と重ね合わせる。この後、所望の期間の培養培養インキュベーターに培養プレートを戻す。まず、培養液を1ウェルあたり1ミリリットルのパラホルムアルデヒド溶液で元生体培養培地に交換し、培養液を固定する。1時間後、3回の5分間のPBSでゲルをすすきます。次に、PBS洗浄を1ウェル当たり2ミリリットルのアジ化ナトリウム溶液に交換する。固定ゲルを摂氏4度で保存します。ステンレススチール製の正方形のエッジスパチュラを使用して、液滴の中心を持ち上げる前に、プレートから液滴を慎重に持ち上げます。丸縁のヘラを使用して、PBSの1ミリリットルを含む12ウェルプレートの個々の井戸に液滴を移す。この後、支持のプレートを傾け、氷冷アセトンメタノール溶液1ミリリットルで液滴を1分間後置します。次に、PBSの3〜5つの2ミリリットルの水ですすいだ。ブロッキング溶液を15分間遠心分離し、残骸を取り除きます。次いで、支持体上のプレートを傾け、500マイクロリットルのブロッキング溶液中の液滴を室温で2時間インキュベートする。テキストプロトコルに従って一次抗体混合物を調製する。その後、丸い縁のヘラを使用して、液滴をラウンドボトム96ウェルプレートに転送します。一次抗体混合物の30マイクロリットルの液滴を摂氏4度で一晩インキュベートする。翌日、液滴を1ウェルあたり2ミリリットルの洗浄液を含む12ウェルプレートに移します。3つの5分間のスケで液滴をすすいでください。その後、9回の30分間の洗浄で液滴を洗います。翌日、PBSで液滴を3回リンスする。テキストプロトコルに従って適切なフルオロフォア共役二次抗体混合物を調製する。前述のように、ラウンドボトム96ウェルプレートに液滴を移し、光から保護された室温で4時間、2次抗体混合物の30マイクロリットルでプレートをインキュベートします。4時間後、液滴を1ウェルあたり2ミリリットルの洗浄液を含む12ウェルプレートに移します。まず、3回の5分間のスケで液滴をすすきます。その後、30分間の洗浄を4回で液滴を洗います。翌日、液滴を洗浄液で5回30分間、PBSで30分間3回洗い流します。翌日、前に示したように、液滴を丸底96ウェルプレートに移します。室温で30分間、Hoechst核染色液を反ステインする。1ウェルあたり2ミリリットルのPBSを含む12ウェルプレートに液滴を移し、PBSで3回リンスします。次に、正方形のカバーガラスの端に沿って速硬化土台の狭い層を塗布し、1分間乾燥させます。次に、脱イオン水を含む12ウェルプレートのウェルに浸して液滴をすすいます。そして、顕微鏡スライドに液滴を移します。次に、15マイクロリットルの非硬化アンチフェード実装媒体を液滴に分配する。取り付け媒体をスライドに向けて液滴の上にそっと置き、落ち着きます。スライドを室温で2時間乾燥させ、一晩摂氏4度で保管します。最後に、20xまたは40xの目的で光学断面機能を備えた直立性の蛍光顕微鏡でスライドをイメージします。このプロトコルでは線維血管組織を調製し、画像化した。代表的なデータは、PDR ex vivo培養がVEGFAに応答してCD-31陽性内皮および血管構造保存の発芽を誘導することを示した。逆に、 TGF