A retinopatia diabética é a complicação microvascular mais comum do diabetes. Este método pode ajudar a responder perguntas-chave sobre a fisiopatologia da doença em estágio final proliferando retinopatia diabética. Esta técnica permite a desconstrução da paisagem de tecido tridimensional nativo e a investigação da fisiopatologia tecidual em material de paciente vivo com relevância clínica direta. Consulte o protocolo de texto para obter detalhes sobre a cirurgia e a instrumentação utilizada na dissecação. Para começar, coloque tecido fibrovascular que tenha sido extirpado de indivíduos humanos submetidos a cirurgia transconjunta de microincção vitreoretinal em um prato de cultura celular contendo PBS estéril. Usando um microscópio estéreo de dissecção vertical, corte o tecido fibrovascular em pedaços de aproximadamente um milímetro quadrado. Submergir o tecido em PBS e manter o tecido no lugar com pinças de micro dissecção. Faça cortes claros no tecido com um bisturi estéril tomando cuidado para evitar rasgar o tecido fibrovascular. Coloque cada pedaço individual de tecido em um poço de uma placa de cultura celular de 12 poços contendo um mililitro de PBS estéril. Primeiro, prepare 25 alíquotas de microliter de solução fibrinogênio à temperatura ambiente. Coloque um pedaço de tecido fibrovascular no centro do poço de uma placa de 24 poços e remova qualquer excesso de PBS. Em seguida, adicione 25 microliters de solução TA a uma das alíquotas fibrinogenais preparadas. E usando outra pipeta definida para 50 microliters mistura por pipetação. Distribua a mistura sobre o pedaço de tecido fibrovascular e pipeta para cima e para baixo para garantir que a peça do tecido esteja contida dentro da gotícula. O tempo de formação de fibrinogênio crítico para a tridimensionalidade da cultura ex vivo, é testado em uma gotícula vazia antes da incorporação do tecido, conforme descrito no protocolo. Incubar a placa em uma incubadora de cultura celular. Após 30 a 60 minutos incline a placa para verificar se o gel de fibrina está completamente formado. Em seguida, sobreponha os géis de fibrina de tecido fibrovascular com meio de cultura ex vivo suplementado com aprotinina. Depois disso, devolva as placas de cultura à incubadora de cultura celular para o período de tempo desejado. Primeiro, substitua o meio de cultura ex vivo por um mililitro de solução paraformaldeída por bem para corrigir as culturas. Depois de uma hora, enxágue os géis com três lavagens PBS de cinco minutos. Em seguida, substitua a lavagem PBS por dois mililitros de solução de azida de sódio por poço. Armazene os géis fixos a quatro graus Celsius.Use uma espátula de borda quadrada de aço inoxidável para levantar cuidadosamente as gotículas da placa, começando pelas bordas antes de levantar o centro da gotícula. Usando uma espátula arredondada transfira as gotículas para poços individuais de uma placa de 12 poços contendo um mililitro de PBS. Depois disso, incline a placa em um suporte e poste as gotículas com um mililitro de solução de metanol de acetona gelada por um minuto. Em seguida, enxágue com três a cinco mililitros de PBS. Centrifugar a solução de bloqueio por 15 minutos para remover quaisquer detritos. Em seguida, incline a placa sobre um suporte e incuba as gotículas em 500 microliters de solução de bloqueio por duas horas em temperatura ambiente. Prepare a mistura de anticorpos primários de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, use uma espátula redonda para transferir as gotículas para uma placa de fundo redondo 96. Incubar as gotículas em 30 microliters de mistura de anticorpos primários por gotícula durante a noite a quatro graus celsius. No dia seguinte, transfira as gotículas para uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de solução de lavagem por poço. Enxágüe as gotículas com três lavagens de cinco minutos. Em seguida, lave as gotículas com nove lavagens de 30 minutos. No dia seguinte, enxágue as gotículas três vezes com PBS. Prepare a mistura de anticorpos secundários conjugados por fluoróforo de acordo com o protocolo de texto. Transfira as gotículas para uma placa de fundo redondo 96, como demonstrado anteriormente, e incubar a placa com 30 microliters de mistura de anticorpos secundários por quatro horas à temperatura ambiente, protegida da luz.Após quatro horas, transfira as gotículas para uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de solução de lavagem por poço. Primeiro, enxágue as gotículas com três lavagens de cinco minutos. Em seguida, lave as gotículas com quatro lavagens de 30 minutos. No dia seguinte, enxágue as gotículas cinco vezes com solução de lavagem por 30 minutos, e três vezes com PBS por 30 minutos. No dia seguinte, transfira as gotículas para uma placa redonda de fundo 96, como demonstrado anteriormente. Contratença as gotículas com mancha nuclear hoechst por 30 minutos em temperatura ambiente. Transfira as gotículas para uma placa de 12 poços contendo dois mililitros de PBS por poço e enxágue três vezes com PBS. Em seguida, aplique uma camada estreita de endurecimento rápido ao longo das bordas de um vidro de cobertura quadrada e deixe secar por um minuto. Em seguida, enxágue a gota mergulhando-a em um poço de 12 poços contendo água deionizada. E transfira a gota para um slide de microscópio. Em seguida, dispense 15 microliters de meio de montagem anti-fade anti-endurecimento não endurecedor na gotícula. Posicione suavemente o vidro de cobertura sobre a gota com o meio de montagem voltado para o slide e deixe-o se acomodar. Deixe os slides secarem por duas horas em temperatura ambiente e armazená-los a quatro graus Celsius durante a noite. Finalmente, imagem os slides com um microscópio de epifluorescência vertical equipado com uma função de secção óptica a 20x ou 40x objetivo. Neste protocolo foi preparado tecido fibrovascular e imageado. Os dados representativos mostraram que as culturas ex vivo do PDR induzem o surgimento do CD-31 positivo e da preservação da vasculatura em resposta à VEGFA. Por outro lado, TGF
