毛利精密切肝片作为肝脏生物学的Ex Vivo模型

本视频演示了精密切肝片作为肝组织生物学实验外活体模型的制作和应用。精密切肝片占据着体内动物研究和体外细胞培养方法之间的实验利基。这项技术比体内动物研究具有几个关键优势，包括使用同一肝脏的控制和治疗样本的能力，分离肝脏组织以去除其他器官系统的离目标效应的能力，以及使用试剂的能力，如果应用于整个活的小鼠，例如有毒通路抑制剂，可能会产生负面影响。

该技术涉及使用横向振动刀片切割超薄的活肝组织肝片，然后实验室组织培养。刀片的振动可防止剪切应力导致撕裂。在此示例中，我们将展示可行的外活肝切片的制剂技术，并演示肝片培养在示例实验中的效用，其中这种外活体组织用胆汁酸进行治疗，以刺激胆汁性肝损伤，以评估肝纤维化机制。

将刀片插入切割臂。使用 70%乙醇溶液对刀片和切割臂进行消毒。始终小心避免与刀片接触。

用 70% 乙醇溶液对缓冲盘进行消毒，然后用无菌组织擦拭。将缓冲托盘插入振动器并拧紧安装螺钉。将切割臂设置为最大可用高度。

检查刀片角度。在我们的振动器上，我们使用从水平到 10 度角，刀片向下倾斜到样品上。确保刀片角度已紧固定。

再次使用 70% 乙醇溶液对试样支架进行消毒。连接位于缓冲盘下的 Peltier 热电冷却器的冷却水。一些振动器型号使用冰浴进行冷却。

将出水管固定到排水沟上，然后打开水。将冷却器设置为 4 摄氏度。向缓冲盘添加冰冷的克雷布斯-亨塞莱特缓冲器。

所有手术器械和材料都应无菌。老鼠应该被深深地麻醉或安乐死。用70%乙醇溶液对小鼠的皮肤表面进行润湿。

将中线切口切入从腹腔底部到隔膜的皮肤。使用干净的钳子和剪刀，打开腹腔。快速切除肝脏，不损害叶。

向下推肝脏，切割肝脏顶部的结缔组织。向上推肝脏。用钳子握住肝脏的中心血管区域，向上拉。

切割结缔组织血管。注意不要损害肝叶，也注意不要切入胃肠道。将切除的肝脏放入冰冷的克雷布斯-亨塞莱特缓冲液的无菌盘中。

将肝脏分离成单独的叶。选择一个肝叶，并放在一个新的无菌菜平侧。在克雷布斯-亨塞莱特缓冲区中将其他叶放在冰上。

修剪肝叶的边缘。修剪很重要，特别是在首先接触切削刀片的边缘，因为组织边缘相对垂直于切削刀片，将防止在浅角下可能发生组织压缩。切割其他三个边缘周围的组织可去除组织边缘的纤维胶囊，并且通常允许更容易去除组织切片。

将薄层氰丙烯酸酯放在试样支架的前边缘，比修剪过的肝叶稍大。使用无菌吸水材料清除组织中任何缓冲液残留物。将肝叶放在氰丙烯酸酯胶水上，最大边缘朝向前面。

允许在空气中固化一到两分钟。将附着在试样支架上的组织放入振动器中。设置振动器速度。

降低切割刀片，直到它位于肝叶的上方。将振动切割臂运行在样品上。此机器上的铲刀振动由脚踏板激活。

向后返回刀片，将刀片高度降低 250 微米。重复此过程，直到去除组织顶层。丢弃第一片或两片，因为这些将包含Glisson的胶囊，因此，不会包含太多的功能性肝组织。

要切割肝片，通过转动手柄，慢慢将振动刀片推进到组织中。在切割过程中，使用小画笔轻轻引导组织。使用画笔拾取切割组织部分，然后将组织部分放入含有 Krebs-Henseleit 缓冲液的无菌管中进行储存。

不使用时，请将根放在冰上。有些时候，组织在切割过程中确实会撕裂，但在大多数情况下，组织仍然可用。切组织切片，直到靠近氰丙烯酸酯胶水。

不要切入胶水。重复与其他肝叶，这是坐在冰上，直到获得所需的组织切片的数量。要清洁试样支架，请使用刀片刮掉胶组织混合物，或者使用丙酮或二甲基硫化物等溶剂软化混合物。

在组织培养罩中，移液器将一个含有10%胎儿牛血清和抗菌素的Williams'E培养素mL放入12井板中。轻轻旋转混合物，倒入无菌盘中，取出组织切片。将组织切成大致均匀的大小。

在此示例中，我们针对表面面积约为 50 毫米方的组织切片。注意检查组织切片的一致性。较暗的切片表明组织厚度增加，应丢弃。

较轻的切片表明存在固化的氰丙烯酸酯胶水，应丢弃。将组织切片转移到含有一毫升介质的 12 井板中。在正常组织培养条件下孵育肝片。

如果可能，使用方法来提高组织切片的氧气供应。在后天，使用手动移液器更换介质，以防止吸气导致组织损失。精密切肝片现已可供实验使用。

对于我们的应用，我们已经用胆汁酸治疗了两天肝片，并在裂解缓冲液中均质化，用于信使RNA提取和qPCR分析。为了检查精密切肝切片在一段时间内的可行性，我们使用ATP水平作为细胞活力的代理。ATP水平被规范化为蛋白质，并在隔离后多个时间点测量。

即时和一小时的样本中，ATP水平有所下降，但恢复时间为三小时。此后，ATP 水平维持了五天，尽管随着时间的推移呈下降趋势。H&E 染色用于检查在培养中保存长达五天的精密切肝片。

组织形态是暗示一些坏死发生在第二天，严重的坏死发生在第五天。由于第二天至第五天发生坏死，我们建议将这项技术的实验用途限制在三天左右。然而，通过使用更好的氧气输送技术来增强组织切片。

精密切肝片似乎也具有增厚的胶原纤维相对于时间在培养。这是自发纤维化过程的暗示。在示例实验中，用三种单独的胆汁酸处理两天，以模拟肝胆汁。

研究三个胆黄细胞特异性基因的mRNA表达，这两种结合胆汁酸，甘油酸和龙酸，显著增加了细胞蛋白-19和康奈辛-43的表达。这与胆血管细胞的发展是一致的。看完此视频后，您应该对如何创建精确切割的肝切片以及如何进行基本组织培养有一个很好的理解。

精密切肝片可用于非常广泛的应用，包括RNA表达、蛋白质表达、表观遗传学、DNA结合、代谢、感染机制、癌症入侵、药理学、细胞生物学和分泌研究的实验研究，举几例。