Diabetische Retinopathie ist die häufigste mikrovaskuläre Komplikation von Diabetes. Diese Methode kann helfen, schlüsselweisen Fragen zur Pathophysiologie der proliferativen diabetischen Retinopathie im Endstadium zu beantworten. Diese Technik ermöglicht die Dekonstruktion der einheimischen dreidimensionalen Gewebelandschaft und die Untersuchung der Gewebepathophysiologie in lebendem Patientenmaterial mit direkter klinischer Relevanz. Im Textprotokoll finden Sie Details zur Operation und zur Instrumentierung, die in der Sezierung verwendet wird. Um zu beginnen, legen Sie fibrovaskuläres Gewebe, das von menschlichen Probanden, die transkonjunktival mikroincision vitreoretinale Chirurgie in einer Zellkulturschale mit sterilen PBS entfernt wurde. Schneiden Sie das fibrovaskuläre Gewebe mit einem aufrechten Sezier-Stereomikroskop in etwa einen Quadratmillimeter ab. Tauchen Sie das Gewebe in PBS und halten Sie das Gewebe an Ort und Stelle mit Mikro-Dissektion Pinzette. Machen Sie klare Schnitte im Gewebe mit einem sterilen Skalpell, das darauf achtet, das fibrovaskuläre Gewebe zu vermeiden. Legen Sie jedes einzelne Stück Gewebe in einen Brunnen einer 12 Brunnenzellkulturplatte, die einen Milliliter sterilen PBS enthält. Bereiten Sie zunächst 25 Mikroliter Aliquots fibrinogenlösung bei Raumtemperatur vor. Legen Sie ein Stück fibrovaskuläres Gewebe in die Mitte des Brunnens einer 24 Brunnenplatte und entfernen Sie überschüssige PBS. Als nächstes fügen Sie 25 Mikroliter TA-Lösung zu einem der vorbereiteten Fibrinogen-Aliquots hinzu. Und mit einer anderen Pipette auf 50 Mikroliter gemischt durch Pipettieren. Geben Sie die Mischung auf das Stück fibrovaskuläres Gewebe und Pipette nach oben und unten, um sicherzustellen, dass das Gewebestück im Tröpfchen enthalten ist. Die Zeit der Fibrinogenbildung, die für die Dreidimensionalität der Ex-vivo-Kultur entscheidend ist, wird in einem leeren Tröpfchen vor der Gewebeeinbettung getestet, wie im Protokoll beschrieben. Inkubieren Sie die Platte in einem Zellkultur-Inkubator. Nach 30 bis 60 Minuten kippen Sie die Platte, um zu überprüfen, ob das Fibrin-Gel vollständig ausgebildet ist. Als nächstes überlagern Sie die fibrovaskulären Gewebefibringele mit ex vivo Kulturmedium mit Aprotinin ergänzt. Danach kehren Sie die Kulturplatten für den gewünschten Zeitraum an den Zellkultur-Inkubator zurück. Ersetzen Sie zunächst das Ex-vivo-Kulturmedium durch einen Milliliter Paraformaldehydlösung pro Brunnen, um die Kulturen zu fixieren. Nach einer Stunde spülen Sie die Gele mit drei fünfminütigen PBS-Waschungen ab. Als nächstes ersetzen Sie die PBS-Waschanlage durch zwei Milliliter Natriumazidlösung pro Brunnen. Bewahren Sie die festen Gele bei vier Grad Celsius auf. Verwenden Sie einen quadratischen Randspachtel aus Edelstahl, um die Tröpfchen vorsichtig von der Platte zu heben, beginnend an den Rändern, bevor Sie die Mitte des Tröpfchens anheben. Mit einem runden Spachtel übertragen Sie die Tröpfchen in einzelne Brunnen einer 12-Well-Platte, die einen Milliliter PBS enthält. Danach die Platte auf eine Stütze kippen und die Tröpfchen mit einem Milliliter eiskaltem Aceton-Methanollösung für eine Minute nachsetzen. Dann spülen Sie mit drei bis fünf Zwei-Milliliter-Washes von PBS. Zentrifugieren Sie die Sperrlösung für 15 Minuten, um Schmutz zu entfernen. Dann kippen Sie die Platte auf einem Träger und inkubieren Sie die Tröpfchen in 500 Mikroliter Blockierlösung für zwei Stunden bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die primäre Antikörpermischung gemäß dem Textprotokoll vor. Dann verwenden Sie einen runden Spachtel, um die Tröpfchen auf eine runde untere 96-Wellplatte zu übertragen. Inkubieren Sie die Tröpfchen in 30 Mikroliter Primärantikörper-Mischung pro Tröpfchen über Nacht bei vier Grad Celsius. Am nächsten Tag die Tröpfchen auf eine 12 Brunnenplatte mit zwei Milliliter Waschlösung pro Brunnen geben. Spülen Sie die Tröpfchen mit drei fünfminütigen Wärten. Dann waschen Sie die Tröpfchen mit neun 30-minuten-Waschungen. Am nächsten Tag die Tröpfchen dreimal mit PBS abspülen. Bereiten Sie das entsprechende fluorophorkonjugierte sekundäre Antikörpergemisch gemäß dem Textprotokoll vor. Die Tröpfchen auf eine runde untere 96-Wellplatte geben, wie zuvor gezeigt, und die Platte mit 30 Mikrolitern Sekundärantikörpergemisch für vier Stunden bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt, bebrüten.Nach vier Stunden die Tröpfchen auf eine 12 Brunnenplatte mit zwei MilliliterWaschlösung pro Brunnen geben. Zuerst spülen Sie die Tröpfchen mit drei fünfminütigen Wärten. Dann waschen Sie die Tröpfchen mit vier 30-Minuten-Waschungen. Am nächsten Tag spülen Sie die Tröpfchen fünfmal mit Waschlösung für 30 Minuten und dreimal mit PBS für 30 Minuten. Am nächsten Tag, übertragen Sie die Tröpfchen auf eine runde untere 96 Brunnenplatte, wie zuvor gezeigt. Die Tröpfchen mit Hoechst-Atomflecken 30 Minuten bei Raumtemperatur gegenfärben. Die Tröpfchen auf eine 12-Well-Platte mit zwei Millilitern PBS pro Brunnen geben und dreimal mit PBS ausspülen. Als nächstes eine schmale Schicht aus schnell härtendem Montagemedium entlang der Ränder eines quadratischen Deckglases auftragen und eine Minute trocknen lassen. Dann spülen Sie das Tröpfchen, indem Sie es in einen Brunnen einer 12 Brunnenplatte mit entionisiertem Wasser tauchen. Und übertragen Sie das Tröpfchen auf ein Mikroskopschlitten. Als nächstes 15 Mikroliter nicht härtendes Anti-Fade-Montagemedium auf das Tröpfchen geben. Positionieren Sie das Deckglas vorsichtig über dem Tröpfchen mit dem Montagemedium zur Rutsche und lassen Sie es sich absetzen. Lassen Sie die Rutschen zwei Stunden bei Raumtemperatur trocknen und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius über Nacht. Schließlich stellen Sie die Dias mit einem aufrechten Epifluoreszenzmikroskop auf, das mit einer optischen Schnittfunktion bei 20x- oder 40x-Objektiv ausgestattet ist. In diesem Protokoll wurde fibrovaskuläres Gewebe vorbereitet und abgebildet. Die repräsentativen Daten zeigten, dass PDR-ex-vivo-Kulturen als Reaktion auf VEGFA das Keimen von CD-31-positivem Endothel und Vaskulaturkonservierung induzieren. Umgekehrt ist TGF
