당뇨병 망막증은 당뇨병의 일반적인 미세 혈관 합병증입니다. 이 방법은 말기 질병 증식 성 당뇨병 망막증의 병리학에 대한 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 직접 임상 관련성을 가진 살아있는 환자 물질에서 네이티브 3차원 조직 경관및 조직 병리학의 조사를 할 수 있습니다. 해부에 활용된 수술 및 계측에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 우선, 멸균 PBS를 포함하는 세포 배양 접시에 간경련 미세 절개 유리석 수술을 받은 인간 과목에서 절제된 섬유혈관 조직을 배치하십시오. 직립 해부 스테레오 현미경을 사용하여 섬유 혈관 조직을 약 1 평방 밀리미터 조각으로 자른다. PBS에 있는 조직을 잠그고 마이크로 해부 핀셋으로 제자리에 조직을 붙입니다. 섬유혈관 조직을 찢는 것을 피하기 위해 돌봐 멸균 메스와 조직에 명확한 상처를 확인합니다. 멸균 PBS의 1 밀리리터를 포함하는 12 잘 세포 배양 판의 우물에 조직의 각 개별 조각을 놓는다. 먼저 실온에서 피브리노겐 용액의 25마이크로리터 알리쿼트를 준비한다. 24 웰 플레이트의 우물 중앙에 섬유 혈관 조직의 한 조각을 배치하고 초과 PBS를 제거합니다. 다음으로, 준비된 피브리노겐 알리쿼트 중 하나에 TA 용액 25마이크로리터를 추가합니다. 그리고 파이펫팅에 의해 50 마이크로 리터 믹스로 설정 된 다른 파이펫을 사용. 섬유혈관 조직 및 파이펫의 조각에 혼합물을 분배하여 조직 조각이 액적 내에 포함되어 있는지 확인합니다. 전 생체 배양의 3차원에 중요한 피브리뇨겐 형성의 시간은 프로토콜에 기재된 바와 같이 빈 액적 선행 조직 포함에서 시험된다. 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다. 30-60분 후에 플레이트를 기울여 피브린 젤이 완전히 형성되어 있는지 확인합니다. 다음으로, 아프로틴으로 보충된 전 생체 배양 배지와 섬유혈관 조직 피브린 젤을 오버레이한다. 그 후, 배양판을 원하는 기간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터로 되돌려 주세요. 먼저, 전 생체 배양 배지를 파라포름알데히드 용액의 1밀리리터로 교체하여 배양을 수정한다. 1시간 후, 젤을 5분 PBS 세워로 헹구는 다. 다음으로 PBS 워시를 양당 2밀리리터의 나트륨 아지드 용액으로 교체하십시오. 고정 젤을 섭씨 4도에 보관하십시오.스테인레스 스틸 제곱 가장자리 주걱을 사용하여 물방울의 중심을 들어 올리기 전에 가장자리에서 시작하여 플레이트에서 물방울을 조심스럽게 들어 올립니다. 둥근 날카로운 주걱을 사용하여 PBS의 1 밀리리터를 포함하는 12 웰 플레이트의 개별 우물로 방울을 전송합니다. 그 후, 접시를 지지에 기울이고 1분 동안 얼음차가운 아세톤 메탄올 용액 1밀리리터로 방울을 포스트픽합니다. 그런 다음 PBS의 3~5밀리리터 세시로 헹구습니다. 15분 동안 블로킹 용액을 원심분리하여 이물질을 제거합니다. 그런 다음, 지지에 접시를 기울이고 실온에서 2 시간 동안 차단 용액의 500 마이크로 리터에 물방울을 배양. 텍스트 프로토콜에 따라 1차 항체 혼합물을 준비한다. 그런 다음 둥근 가장자리 주걱을 사용하여 물방울을 라운드 하단 96 웰 플레이트로 전송합니다. 4섭씨에서 하룻밤 동안 액적당 1차 항체 혼합물30 마이크로리터에 액적을 배양한다. 다음 날, 잘 당 세척 용액의 두 밀리리터를 포함하는 12 웰 플레이트에 방울을 전송합니다. 3개의 5분 세차재로 물방울을 헹구는 다. 그런 다음 9 개의 30 분 세척으로 물방울을 씻으시면 됩니다. 다음 날 PBS로 물방울을 세 번 헹구는 다. 텍스트 프로토콜에 따라 적절한 불소-공액이 있는 이차 항체 혼합물을 준비한다. 이전에 입증된 바와 같이, 원형 하단 96 웰 플레이트로 액적을 옮기고, 실내 온도에서 4시간 동안 30마이크로리터의 이차 항체 혼합물로 플레이트를 배양하여 빛으로부터 보호한다.4시간 후, 방울을 12개의 웰 플레이트로 옮기면 2밀리리터의 세정용액을 잘 들어 보입니다. 먼저, 3개의 5분 세정으로 물방울을 헹구는 다. 그런 다음 4 개의 30 분 세척으로 물방울을 씻으시면 됩니다. 다음 날, 30 분 동안 세척 용액으로 물방울을 5 번 헹구고 PBS로 30 분 동안 3 번 헹구습니다. 다음 날, 이전에 설명한 대로, 라운드 하단 96 웰 플레이트로 방울을 전송합니다. 상온에서 30분 동안 Hoechst 핵 얼룩으로 물방울을 카운터스테인하십시오. 액적을 12개의 웰 플레이트로 옮기고, PBS당 PBS 2밀리리터를 함유하고 PBS로 세 번 헹구는다. 다음으로, 사각형 커버 유리의 가장자리를 따라 빠른 경화 장착 매체의 좁은 층을 적용하고 1 분 동안 건조 할 수 있습니다. 그런 다음, 탈온화 된 물을 포함하는 12 웰 플레이트의 우물에 찍어 방울을 헹구십시오. 그리고 현미경 슬라이드로 액적을 전송합니다. 다음으로, 비경화 방지 장착 배지의 15 마이크로리터를 액적에 분배합니다. 커버 유리를 물방울 위에 부드럽게 놓고 슬라이드를 향한 마운팅 미디엄을 넣고 정착시키십시오. 실온에서 2시간 동안 슬라이드를 건조시키고 밤새 섭씨 4도에 보관하십시오. 마지막으로, 20배 또는 40배 의 목표에서 광학 단면 기능을 갖춘 수직 성피 현미경으로 슬라이드를 이미지합니다. 이 프로토콜에서 섬유혈관 조직은 제조 및 이미지화되었다. 대표적인 데이터는 PDR ex 생체권 배양물이 VEGFA에 대응하여 CD-31 양성 내피 및 혈관 보존의 발아를 유도하는 것으로 나타났다. 반대로, TGF
