使用重组病毒是一项强大的技术，既可以破译病毒复制机制，又为疫苗提供开发平台。同样，从最基本的研究到应用研究，生成高质量的病毒存量对于每一个病毒研究都至关重要。拯救重组病毒、最佳收获、冷冻和 RSV 库存滴定是所有病毒学研究的关键方法。
它们可能被视为传统，但仍然很微妙，需要特定的专门知识。转染前一天，以每毫升浓度0.5百万细胞，将BSR-T7/5细胞悬浮在完整的介质中。在六井板中分配每井两毫升的细胞悬浮液。
在37摄氏度的二氧化碳中孵育，直到第二天达到80-90%的汇合。为了拯救每种病毒，首先将解冻的反向遗传学载体混合在管子中，然后按照转染试剂制造商的协议进行转染。接下来，在混合载体中加入250微升的减少血清介质。
在另一根管子中，在减少血清介质的250微升中稀释10微升这种转染试剂。轻轻旋转两个管子，等待五分钟。混合两个管的内容，并在室温下等待20分钟。
同时，用一毫升的减少血清介质冲洗BSR-T7/5细胞，并免费分配1.5毫升的最低必需介质抗生素，每井补充10%的胎儿小牛血清。如有必要，在5%的二氧化碳环境中在37摄氏度下孵育。经过20分钟的孵育，在每一个井中加入500微升的转染混合物。
在5%的二氧化碳环境中在37摄氏度下孵育细胞三天。为了监测救援效率，在倒置荧光显微镜下以每天20倍的放大倍率观察GGFP荧光。在转染的第三天，在转染BSR-T7/5六井板的每个井中刮伤细胞。
将每井的细胞和上流液转移到无菌的两毫升微离心管中。要从细胞膜中释放被救出的病毒，每个管子的涡流至少30秒。对于第一次扩增被救出的病毒，首先从前一天播种的HEp-2板中去除培养培养剂，然后快速添加500微升每井的新鲜通道-零病毒悬浮液。
将 HEp-2 板在 37 摄氏度的跷跷板摇杆上放置两个小时的软搅拌。要产生被拯救病毒的第一个通道，丢弃500微升的中分，并加入两毫升的 MEM 与 2%FCS。在37摄氏度的二氧化碳中孵育37摄氏度，为期三天。
要以20倍的放大率在倒荧光显微镜下监测感染情况，观察感染通道零悬浮液的HEp-2细胞的GGFP荧光。在亮场显微镜下，观察小同步和细胞分离的外观，这反映了RSV细胞病变效应。为了放大被救的病毒，首先稀释无FCS MEM的病毒悬浮液，以每毫升5万PFU获得三毫升悬浮液，然后从HEp-2烧瓶中去除介质。
快速添加三毫升病毒悬浮液，并在 37 摄氏度的跷跷板摇杆上孵化烧瓶，进行软搅拌两个小时。接下来，取出并丢弃 inoculum，并添加 15 毫升 MEM 与 2%FCS。在37摄氏度的二氧化碳中孵育2至4天。
要估计收获病毒的准确时间，请在 20 倍放大的倒荧光显微镜下检查细胞形态和 GFP 荧光。请注意，这通常是当 50% 到 80% 的 HEp-2 细胞层由于感染后 48 到 72 小时之间发生的 RSV 细胞病变效应而分离时。接下来，使用单元格刮刀刮取所有单元格。
将细胞和上一液收集在一起，并转移到50毫升的离心管。添加 10X RSV 保护解决方案的 1/10 体积。用力旋转管5秒钟，在200倍g下离心5分钟，以澄清悬浮液。
将上一液转移到50毫升的管子上。在标有耐酒精标签的低温管中，涡流短暂地和等同。将管子浸入预冷、零下80摄氏度的酒精中至少一小时，并将其存放在零下80摄氏度。
要进行斑块滴定测定，首先通过用无菌水稀释商用10X MEM并加入L-谷氨酰胺、每毫升青霉素1000个单位和每毫升链霉素1毫克，使至少2倍的必需介质。大力摇动稀释液并将其储存在4摄氏度，然后将900微升的无FCS MEM添加到6个管中。解冻病毒等分，并大力旋转五秒钟。
为了进行连续稀释，首先在第一管的900微升介质中加入100微升病毒。将盖子放在管子上，通过涡旋混合几秒钟，然后在第一个稀释的100微升中加入第二管中的900微升介质。把盖子放在管子上，然后旋涡。
重复此过程，直到第六管。在HEp-2 12孔板上写上病毒名称和全部稀释。添加一个标记来匹配板及其盖，因为它们可能在染色过程中分离。
从板材上拆下介质，每孔分配 400 微升稀释剂。在37摄氏度下孵育板，用于病毒吸附两小时。在病毒吸附过程中，首先将2X MEM的pH值调整为7.2左右，在颜色指示器之后用7.5%的无菌碳酸氢钠溶液准备微晶纤维素覆盖。
为了获得100毫升的覆盖物，加入10毫升2X MEM，10毫升2.4%单晶纤维素悬浮液，80毫升的M......辅以2%的FCS，并大力混合。在两个小时的孵育结束时，在12孔板的每个孔中加入两到三毫升的覆盖物，而不去除孵化。在37摄氏度的二氧化碳中孵育6天。
要用水晶紫罗兰溶液染色细胞，首先轻轻摇动板，以脱下微晶纤维素覆盖物。取出超自然剂，用1X PBS清洗细胞两次，然后加入1至2毫升的水晶紫罗兰溶液，等待10至15分钟。拆下溶液，该溶液可重复使用，用于后续的板染色。
最后计算病毒滴度作为干板井中可见斑块数的一小部分，以及烧液量和稀释。对负对照进行斑块测定，仅转染N、P、L和M2-1的表达质粒，在最低稀释时未发现斑块。如果救援是有效的，从转染细胞获得的滴答声预计高于每毫升100PFU。
在通道上增加的滴答声在通道上达到每毫升100万至1000万PFU。由于这些荧光病毒，可以容易地观察和测量针对蛋白质N和细胞蛋白IMPDH的siRNA对RSV表达的抑制。相比之下，观察和测量了与非靶向siRNA或与siRNA对细胞蛋白GAPDH进行转染的控制细胞上的强GP信号。
同样，这些病毒能够通过抗病毒药物化合物轻松观察RSV乘法的抑制作用。跟踪HEp-2感染细胞中的荧光蛋白M2-1表明IB和IB相关颗粒是非常动态的结构。被观察到的MB是移动和球形结构，能够融合并形成更大的球形内含物。
IB相关颗粒经历了连续的组装-分解周期，形成与IB相关的小颗粒，这些颗粒生长，融合成大型IB相关颗粒，然后消失。使用微晶纤维素覆盖的RSV斑块滴定协议可以很容易地适应其他细胞和/或其他病毒。这将需要调整微晶纤维素的浓度。
