Использование рекомбинантных вирусов является мощной технологией как для расшифровки механизмов репликации вируса, так и для обеспечения платформ разработки вакцин. Аналогичным образом, генерация высококачественных вирусных запасов имеет решающее значение для каждого вирусного исследования от самых фундаментальных исследований до прикладных исследований. Спасение рекомбинантных вирусов, оптимальный сбор урожая, замораживание и титрование запасов РСВ являются важнейшими методами для всех вирусологических исследований.
Их можно считать традиционными, но они остаются деликатными и требуют специальных знаний. За день до трансфекции приостанавливайте клетки BSR-T7/5 в полной среде при концентрации 0,5 миллиона клеток на миллилитр. Распределить два миллилитров клеточной подвески на колодец в шести-хорошо пластины.
Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа, пока они не достигнут 80-90% слияния на следующий день. Чтобы спасти каждый вирус, сначала смесь разморозила обратные векторы генетики в трубке, а затем перейти к трансфекции, следуя протоколу производителя трансфекции реагентов. Далее добавьте 250 микролитров уменьшенной среды сыворотки к смешанным переносчикам.
В другой трубке разбавляют 10 микролитров этого трансфектного реагента в 250 микролитров пониженной среды сыворотки. Аккуратно вихрем обе трубки и ждать пять минут. Смешайте содержимое обеих трубок и подождите 20 минут при комнатной температуре.
Между тем, промыть клетки BSR-T7/5 с одним миллилитром уменьшенной среды сыворотки и распространять 1,5 миллилитра минимальных необходимых антибиотиков сми бесплатно дополняется 10%фетальной сыворотки теленка на колодец. При необходимости инкубировать при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислом газе окружающей среды. После 20-минутной инкубации добавьте в каждую колодец 500 микролитров трансфекции.
Инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия в 5%углекислого газа окружающей среды в течение трех дней. Чтобы контролировать эффективность спасения, наблюдайте при флуоресценции GFP под перевернутым флуоресцентным микроскопом при 20X увеличении один раз в день. На третий день трансфекции, царапинные клетки в каждом колодеце трансфицированных BSR-T7/5 шести-хорошо пластины.
Передача клеток и супернатант каждого хорошо в стерильные двухми миллилитров микроцентрифуг трубки. Чтобы освободить спасенный вирус от клеточных мембран, вихрь каждой трубки энергично, по крайней мере 30 секунд. Для первого усиления спасенных вирусов сначала удалите культурную среду из пластины HEp-2, посеянной накануне, а затем быстро добавьте 500 микролитров на колодец свежей вирусной подвески.
Поместите пластину HEp-2 при 37 градусах по Цельсию на качели рокер для мягкого возбуждения в течение двух часов. Чтобы произвести первый проход спасенных вирусов, отбросьте 500 микролитров инокулума и добавьте два миллилитров MEM с 2%FCS. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение трех дней.
Чтобы контролировать инфекцию под перевернутым флуоресцентным микроскопом при увеличении 20X, наблюдайте флуоресценцию GFP клеток HEp-2, инфицированных нулевой подвеской один раз в день. Под ярким микроскопом наблюдайте появление небольшой синцитии и клеточного отслоения, что отражает цитопатический эффект RSV. Чтобы усилить спасенные вирусы, сначала разбавить вирусную подвеску МЧС без FCS, чтобы получить трехми миллилитровую подвеску на 50 000 ПФУ на миллилитр, а затем удалить носитель из колбы HEp-2.
Быстро добавьте трехми миллилитровую вирусную суспензию и инкубировать колбу при 37 градусах по Цельсию на качели рокер для мягкого возбуждения в течение двух часов. Затем удалите и отбросьте инокулум и добавьте 15 миллилитров MEM с 2%FCS. Инкубация при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение двух-четырех дней.
Чтобы оценить правильное время для сбора вирусов, проверьте морфологию клеток и флуоресценцию GFP под перевернутым флуоресцентным микроскопом при увеличении 20X. Обратите внимание, что это, как правило, когда от 50%до 80% слоя клеток HEp-2 отделяется из-за RSV цитопатический эффект, который происходит между 48 и 72 часов после инфекции. Затем соскребать все клетки с помощью сотового скребка.
Соберите клетки и супернатант вместе и перенесите их в 50-миллилитровую центрифугу. Добавьте 1/10 объема решения по сохранению 10X RSV. Vortex трубки энергично в течение пяти секунд и центрифуги в течение пяти минут при 200 раз г, чтобы прояснить подвеску.
Перенесите супернатант в 50-миллилитровую трубку. Vortex кратко и aliquot подвеска в криогенных трубок помечены спиртосоустойчивых тегов. Погрузите трубку в предварительно охлажденный, минус 80 градусов по Цельсию алкоголя, по крайней мере один час и хранить их при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Для выполнения анализа титаций бляшек, сначала сделайте 2X минимально необходимую среду, разбавляя коммерческий 10X MEM стерильной водой и добавляя L-глутамин, 1000 единиц на миллилитр пенициллина и один миллиграмм на миллилитр стрептомицин. Встряхните разбавления энергично и хранить его при четырех градусах по Цельсию, а затем добавить 900 микролитров FCS-бесплатно MEM до шести трубок. Оттепель вирус aliquots и вихрь их энергично в течение пяти секунд.
Чтобы сделать серийные разбавления, сначала добавьте 100 микролитров вируса в 900 микролитров среды в первой трубке. Положите крышку на трубку и смешайте ее содержимое вихрем в течение нескольких секунд, затем добавьте 100 микролитров первого разбавления до 900 микролитров среды во второй трубке. Положите крышку на трубку и вихрь.
Повторите эту процедуру до шестой трубки. Напишите название вируса и полное разбавления на пластинах HEp-2 12-хорошо. Добавьте отметку, чтобы соответствовать пластине и ее крышке, потому что они могут быть разделены во время окрашивания.
Снимите среду с пластин и распределим 400 микролитров одного разбавления на колодец. Инкубировать пластины при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов для вирусов adorption. Во время распространения вируса подготовьтесь к наложению микрокристаллической целлюлозы, сначала регулируя рН 2X MEM примерно до 7,2 с стерильным раствором бикарбоната натрия на уровне 7,5%после цветового индикатора.
Чтобы получить 100 миллилитров наложения, добавьте 10 миллилитров 2X MEM, 10 миллилитров 2,4%монокристаллической целлюлозной суспензии и 80 миллилитров MEM, дополненных 2%FCS и энергично смешивайте. В конце двухчасовой инкубации добавьте два-три миллилитров наложения к каждому колодец из 12-хорошо пластин, не снимая инокулы. Инкубировать пластину при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа в течение шести дней.
Чтобы испачкать клетки кристально фиолетовым раствором, сначала аккуратно встряхните пластины, чтобы снять микрокристаллическое накладное покрытие целлюлозы. Удалить supernatants и мыть клетки дважды с 1X PBS, а затем добавить от одного до двух миллилитров кристально фиолетовый раствор и ждать от 10 до 15 минут. Удалите раствор, который можно повторно использовать для последующего окрашивания пластин.
Окончательно вычисляйте титеры вируса как часть числа видимых бляшек в колодцах сухих плит и объема inoculum и разбавления. Выполняя анализ бляшки на отрицательном контроле, трансфицированный только экспрессионными плазмидами N, P, L и M2-1, не выявил налета при самом низком разбавлении. Титеры, полученные из трансфицированных клеток, должны были быть выше 100 ПФУ на миллилитр, если спасение было эффективным.
Титеры увеличились над проходами, чтобы достичь одного миллиона до 10 миллионов ПФУ на миллилитр при прохождении одного или двух. Благодаря этим флуоресцентным вирусам можно легко наблюдать и измерять ингибирование экспрессии РСВ с помощью siRNA, нацеленной на белок N и клеточный белок IMPDH. В отличие от этого, был замечен и измерен сильный сигнал GFP о контрольных клетках, трансфицированных нецелевых siRNA или клетками, трансфицированными с siRNA против клеточного белка GAPDH.
Аналогичным образом эти вирусы позволили легко наблюдения ингибирования РСВ умножения на противовирусные соединения наркотиков. Отслеживание флуоресцентного белка M2-1 в HEp-2-инфицированных клетках показало, что IBs и связанные с IB гранулы являются очень динамическими структурами. IBs были замечены как мобильные и сферические структуры, способные сплавляться и формировать большие сферические включения.
Связанные с IB гранулы прошли непрерывные циклы сборки-разборки с образованием небольших связанных с IB гранул, которые росли, слились в большие гранулы, связанные с IB, а затем исчезли. Протокол титрование Бляшек РСВ с использованием микрокристаллической целлюлозы может быть легко адаптирован к другим клеткам и/или другим вирусам. Это потребует корректировки концентрации микрокристаллической целлюлозы.
