Rekombinant virüslerin kullanımı hem viral çoğaltma mekanizmalarını çözmek hem de aşılar için geliştirme platformları sağlamak için güçlü bir teknolojidir. Aynı şekilde, kaliteli viral stok üretimi uygulanan çalışmalara en temel araştırma her viral çalışma için çok önemlidir. Rekombinant virüslerin kurtarılması, optimum hasat, dondurma ve RSV stoklarının titrasyonu tüm virolojik çalışmalar için kritik yöntemlerdir.
Onlar geleneksel olarak kabul edilebilir ama hassas kalır ve özel uzmanlık gerektirir. Transfeksiyondan bir gün önce, mililitre konsantrasyonu başına 0,5 milyon hücrede BSR-T7/5 hücrelerini tam ortamda askıya alın. Altı kuyulu bir plaka içinde iyi başına hücre süspansiyon iki mililitre dağıtın.
Plakayı 37 derecede %5 karbondioksitle inkübünle ertesi gün %80-90'a ulaşana kadar. Her virüsü kurtarmak için, önce bir tüpte çözülmüş ters genetik vektörleri karıştırın, sonra transfeksiyon reaktifi üreticisinin protokolüne göre transfeksiyona devam edin. Sonraki karışık vektörler için azaltılmış serum orta 250 mikrolitre ekleyin.
Başka bir tüpte, azaltılmış serum ortamının 250 mikrolitresinde bu transfeksiyon reaktifinin 10 mikrolitresini seyreltin. Yavaşça her iki tüp girdap ve beş dakika bekleyin. Her iki tüpün içeriğini karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika bekleyin.
Bu arada, azaltılmış serum orta bir mililitre ile BSR-T7/5 hücreleri durular ve az % 10 fetal buzağı serumu ile takviye minimum temel medya antibiyotikler ücretsiz 1.5 mililitre dağıtmak. Gerekirse, %5 karbondioksit ortamında 37 santigrat derecede kuluçkaya yatırın. 20 dakikalık kuluçkadan sonra, her kuyuya 500 mikrolitre transfeksiyon karışımı ekleyin.
Hücreleri 37 derecede %5 karbondioksit ortamında üç gün kuluçkaya yatırın. Kurtarma verimliliğini izlemek için, gfp floresansını günde bir kez 20X büyütme de ters floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Transfeksiyonun üçüncü gününde, transfected BSR-T7/5 altı kuyuplakasının her bir kuyudaki hücreleri çizin.
Transfer hücreleri ve steril bir iki mililitrelik mikrosantrifüj tüp içine her kuyunun supernatant. Kurtarılan virüsü hücre zarlarından çıkarmak için her tüpü en az 30 saniye şiddetle girdaplayın. Kurtarılan virüslerin ilk amplifikasyon için, ilk hep-2 plaka önceki gün tohumlu kültür ortamı kaldırmak, sonra hızlı bir şekilde taze geçiş sıfır viral süspansiyon kuyu başına 500 mikrolitre ekleyin.
HEp-2 plakasını 37 derecede, iki saat boyunca yumuşak bir ajitasyon için bir tahterevalli rocker'ın üzerine yerleştirin. Kurtarılan virüslerin ilk geçişini üretmek için, inoculum 500 mikrolitre atın ve% 2 FCS ile MEM iki mililitre ekleyin. Plakayı 37 derecede %5 karbondioksitle üç gün boyunca kuluçkaya yatırın.
20X büyütmede ters floresan mikroskobu altında enfeksiyonu izlemek için, günde bir kez geçiş sıfır süspansiyon ile enfekte HEp-2 hücrelerinin GFP floresansını gözlemleyin. Bir brightfield mikroskop altında, rsv sitopatik etkisini yansıtan küçük senytia ve hücre kopması görünümünü gözlemleyin. Kurtarılan virüsleri yükseltmek için, önce FCS içermeyen MEM'in viral süspansiyonundan seyreltin ve mililitrede 50, 000 PFU'da üç mililitrelik süspansiyon elde edin, sonra da ortamı HEp-2 şişesinden çıkarın.
Hızlı bir şekilde üç mililitrelik viral süspansiyon ekleyin ve iki saat boyunca yumuşak ajitasyon için bir tahterevalli rocker üzerinde 37 santigrat derece şişe kuluçka. Sonra inoculum çıkarın ve atın ve% 2 FCS ile MEM 15 mililitre ekleyin. 2-4 gün boyunca %5 karbondioksitte 37 derecede kuluçkaya yat.
Virüsleri hasat etmek için doğru zamanı tahmin etmek için, 20X büyütmede ters floresan mikroskobu altında hücre morfolojisini ve GFP floresansını kontrol edin. Bu genellikle HEp-2 hücre tabakasının% 50 ila% 80 48 ve 72 saat enfeksiyon sonrası meydana gelen RSV sitopatik etkisi nedeniyle ayrılır olduğunu unutmayın. Sonra bir hücre kazıyıcı kullanarak tüm hücreleri kazıyın.
Hücreleri ve supernatant birlikte toplamak ve 50 mililitrelik santrifüj tüp aktarın. 10X RSV koruma çözeltisinin hacminin 1/10'una ekleyin. Girdap tüpler ivedilikle beş saniye ve santrifüj beş dakika için 200 kez g süspansiyon açıklığa kavuşturmak için.
Süpernatant'ı 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Vortex kısaca ve alkole dirençli etiketleri ile etiketlenmiş kriyojenik tüplerde süspansiyon aliquot. Tüpü önceden soğutulmuş, eksi 80 santigrat derece alkole en az bir saat batırın ve eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Bir plak titrasyon tahsini gerçekleştirmek için, ilk steril su ile ticari 10X MEM seyreltme ve L-glutamin ekleyerek 2X minimum gerekli orta yapmak, mililitre penisilin başına 1,000 adet, ve mililitre streptomisin başına bir miligram. Seyreltme şiddetle çalkalayın ve dört santigrat derecede saklayın, sonra altı tüpler için FCS içermeyen MEM 900 mikrolitre ekleyin. Virüsü çöz ve beş saniye boyunca şiddetle girdap.
Seri seyreltme yapmak için, ilk tüp orta 900 mikrolitre virüs 100 mikrolitre ekleyin. Tüpün kapağını yerleştirin ve birkaç saniye girdap yaparak içindekileri karıştırın, ardından ikinci tüpte ortamın 900 mikrolitresine ilk seyreltmenin 100 mikrolitresini ekleyin. Kapağı tüpe ve girdaba koy.
Altıncı tüpkadar bu işlemi tekrarlayın. HEp-2 12-kuyu plakaları üzerinde virüs adı ve tam seyreltme yazın. Onlar boyama sırasında ayrılmış olabilir, çünkü plaka ve kapağı maç için bir işaret ekleyin.
Plakalar orta çıkarın ve kuyu başına bir seyreltme 400 mikrolitre dağıtmak. Plakaları virüs adsorpsiyonu için iki saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Virüs adsorpsiyonsırasında, 2X MEM'in pH'ını renk göstergesini takip eden %7,5'te steril sodyum bikarbonat çözeltisi ile yaklaşık 7,2'ye ayarlayarak mikrokristalin selüloz kaplamasını hazırlayın.
Bindirme 100 mililitre elde etmek için, 2X MEM 10 mililitre ekleyin, 2.4% monokristalin selüloz süspansiyon 10 mililitre, ve MEM 80 mililitre ile birlikte 2% FCS ve şiddetle karıştırın. İki saatlik kuluçka sonunda, inoculum çıkarmadan 12 kuyu plakaları her kuyuya bindirme iki ila üç mililitre ekleyin. Plakayı 6 gün boyunca %5 karbondioksitle 37 derecede kuluçkaya yatırın.
Kristal mor çözelti ile hücreleri leke için, ilk yavaşça mikrokristalin selüloz bindirme çıkarmak için plakaları sallamak. Supernatants çıkarın ve 1X PBS ile iki kez hücreleri yıkayın, sonra kristal mor çözeltisi bir ila iki mililitre ekleyin ve 10 ila 15 dakika bekleyin. Sonraki plaka boyama için yeniden kullanılabilir çözelti, çıkarın.
Son olarak kuru plakalar ve inoculum hacmi ve seyreltme kuyularında görünür plak sayısının bir kısmını olarak virüs titreleri hesaplayın. Negatif kontrol üzerinde bir plak tetkik, N, P, L ve M2-1 sadece ifade plazmidleri ile transfected en düşük seyreltme hiçbir plak ortaya. Transfected hücrelerden elde edilen titrelerin, kurtarma nın verimli olması durumunda mililitre başına 100 PFU'nun üzerinde olması bekleniyordu.
Titreler pasajlar üzerinde bir ya da iki geçitte mililitre başına bir milyon 10 milyon PFU ulaşmak için arttı. Bu floresan virüsler sayesinde N proteinini ve hücresel protein IMPDH'yi hedef alan siRNA ile RSV ekspresyonunun inhibisyonu kolayca gözlemlenebilir ve ölçülebilir. Buna karşılık, hücresel protein GAPDH'ye karşı siRNA ile transfeced olmayan siRNA veya hücreler ile transfected kontrol hücreleri üzerinde güçlü bir GFP sinyali gözlendi ve ölçüldü.
Aynı şekilde bu virüsler bir antiviral ilaç bileşik tarafından RSV çarpma inhibisyonu kolay gözlem sağladı. HEp-2-enfekte hücrelerde floresan protein M2-1 izleme çok dinamik yapılar olarak IBve IB ilişkili granüller gösterdi. İB'ler, daha büyük küresel inkişmeler oluşturabilen ve kaynaşabilen mobil ve küresel yapılar olarak gözlenmiştir.
IB ile ilişkili granüller, büyüyen, büyük IB ilişkili granüller içine erimiş ve daha sonra kayboldu küçük IB ilişkili granüloluşumu ile sürekli montaj-dezassembly döngüleri yapıldı. Mikrokristalin selüloz kaplaması kullanılarak RSV plak titrasyonu protokolü diğer hücrelere ve/veya diğer virüslere kolayca adapte edilebilir. Bu mikrokristalin selüloz konsantrasyonu ayarlama gerektirir.
