組換えウイルスの使用は、ウイルス複製メカニズムを解読し、ワクチンの開発プラットフォームを提供する強力な技術です。同様に、良質のウイルスストックの生成は、最も基本的な研究から応用研究まで、すべてのウイルス研究にとって非常に重要です。組換えウイルスの救出、最適な収穫、凍結、およびRSV株の滴定は、すべてのウイルス学的研究にとって重要な方法です。
彼らは伝統的と見なされるかもしれませんが、繊細なままであり、特定の専門知識を必要とします。トランスフェクションの前日、BSR-T7/5細胞を完全培地で1ミリリットル当たり0.5百万細胞で中断する。6ウェルプレートにウェルあたり2ミリリットルの細胞懸濁液を分配する。
翌日80~90%の合流に達するまで、5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。各ウイルスを救出するために、まずチューブ内の逆遺伝学のベクターを解凍混合し、トランスフェクション試薬メーカーのプロトコルに従ってトランスフェクションに進みます。次に、還元した血清培地の250マイクロリットルを混合ベクターに加える。
別のチューブでは、このトランスフェクション試薬の10マイクロリットルを250マイクロリットルの還元血清培地で希釈する。両方のチューブを穏やかに渦し、5分間待ちます。両方のチューブの内容物を混ぜ、室温で20分待ちます。
一方、BSR-T7/5細胞を1ミリリットルの減らされた血清培地でリンスし、1.5ミリリットルの最小必須培地抗生物質を1.5ミリリットル無料で配布し、1ウェルあたり10%の胎児子牛血清を添加する。必要に応じて、5%の二酸化炭素環境で摂氏37度でインキュベートします。20分間のインキュベーションの後、各井戸に500マイクロリットルのトランスフェクションミックスを加えます。
5%の二酸化炭素環境で37°Cで細胞を3日間インキュベートする。救助効率を監視するには、1日1回20倍の蛍光顕微鏡で蛍光を反転してGFPで観察します。トランスフェクションの3日目に、トランスフェクションBSR-T7/5 6ウェルプレートの各ウェルに細胞を傷つける。
細胞と上清を各ウェルに無菌2ミリリットルマイクロ遠心分離チューブに移す。細胞膜から救出されたウイルスを放出するために、各チューブを少なくとも30秒間激しく渦を起たむ。救出されたウイルスの最初の増幅のために、最初に前日に播種されたHEp-2プレートから培養培地を取り除き、次に新鮮な通路ゼロウイルス懸濁液のウェルあたり500マイクロリットルを素早く加える。
HEp-2プレートをシーソーロッカーの上に摂氏37度で2時間置き、柔らかい攪拌を行います。救出されたウイルスの最初の通路を作り出すために、接種物の500マイクロリットルを捨て、2%FCSでMEMの2ミリリットルを加える。3日間の5%の二酸化炭素で37°Cでプレートをインキュベートします。
20倍の蛍光顕微鏡下での感染をモニターするには、1日1回、通過ゼロ懸濁液に感染したHEp-2細胞の蛍光GFPを観察する。明視野顕微鏡下で、RSV細胞パシー効果を反映した小さな同期および細胞剥離の出現を観察する。救出されたウイルスを増幅するために、まずFCSフリーMEMのウイルス懸濁液を希釈し、1ミリリットル当たり50,000PFUで3ミリリットルの懸濁液を得てから、次いでHEp-2フラスコから培地を取り除く。
3ミリリットルのウイルス懸濁液を素早く加え、シーソーロッカーに37°Cでフラスコを2時間の柔らかい攪拌のためにインキュベートします。次に、接種を取り除いて廃棄し、2%FCSで15ミリリットルのMEMを追加します。2~4日間、5%の二酸化炭素で摂氏37度でインキュベートする。
ウイルスを収穫する適切な時期を推定するには、20倍の蛍光顕微鏡で細胞の形態とGFP蛍光をチェックします。これは通常、感染後48〜72時間の間に起こるRSV細胞パシー効果のためにHEp-2細胞層の50%〜80%が剥離される場合に注意してください。次に、セルスクレーパーを使用してすべてのセルをスクレイプします。
細胞と上清の両方を一緒に収集し、50ミリリットルの遠心分離管に移します。10X RSV保全ソリューションのボリュームの1/10を追加します。チューブを5秒間激しく、遠心分離機を200回gで5分間ボルテックスして懸濁液を明らかにする。
上清を50ミリリットルのチューブに移します。渦はアルコール耐性タグで標識された極低温管の懸濁液を短時間、アリコートする。チューブを少なくとも1時間冷やしてマイナス80度のアルコールに浸し、マイナス80度で保管します。
プラーク滴定アッセイを行う場合は、まず、市販の10X MEMを滅菌水で希釈し、L-グルタミン、1ミリリットルペニシリンあたり1,000単位、ミリリットルレンサマイシンあたり1ミリグラムを添加して、2倍の最小必須培地を作ります。希釈液を激しく振り、摂氏4度で保存し、FCSフリーMEMの900マイクロリットルを6本のチューブに加えます。ウイルスのアリコートを解凍し、5秒間精力的にそれらを渦。
連続希釈を行うために、最初のチューブ内の培地の900マイクロリットルにウイルスの100マイクロリットルを追加します。キャップをチューブに置き、数秒間渦を入れて内容物を混ぜ、第2チューブの培地の900マイクロリットルに最初の希釈液の100マイクロリットルを加えます。キャップをチューブと渦に置きます。
6本目のチューブまでこの手順を繰り返します。HEp-2 12ウェルプレートにウイルス名と完全な希釈液を書いてください。プレートとカバーに合わせてマークを追加します。
プレートから培地を取り出し、ウェルあたり1希釈の400マイクロリットルを分配します。ウイルス吸着のために2時間摂氏37度でプレートをインキュベートします。ウイルス吸着中、最初に2X MEMのpHを7.2程度に調整し、7.5%の無菌炭酸ナトリウム溶液を色表示に従って調製します。
100ミリリットルのオーバーレイを得るために、2X MEMの10ミリリットル、2.4%単結晶セルロース懸濁液の10ミリリットル、および2%FCSを補ったMEMの80ミリリットルを加え、激しく混ぜます。2時間のインキュベーションの終わりに、接種を取り除かずに12ウェルプレートの各ウェルに2〜3ミリリットルのオーバーレイを加えます。5%の二酸化炭素で37°Cでプレートを6日間インキュベートします。
結晶バイオレット溶液で細胞を染色するには、まずプレートを軽く振って微結晶セルロースオーバーレイを取り除きます。上清を取り除き、1X PBSで細胞を2回洗い、水晶紫色溶液を1~2ミリリットル加え、10~15分待ちます。溶液を取り除き、その後のプレート染色に再利用できます。
最後に、ウイルス価をドライプレートのウェル内の目に見えるプラークの数の割合と、接種量と希釈量として計算します。陰性対照に対してプラークアッセイを行い、N、P、L、およびM2-1の発現プラスミドのみでトランスフェクトした場合、最も低い希釈ではプラークが認めなくなった。トランスフェクトされた細胞から得られた力乗器は、救助が効率的であれば、1ミリリットル当たり100 PFUを超えると予想された。
力乗器は、通路1〜2のミリリットル当たり100万〜1000万PFUに達するために通路の上に増加しました。これらの蛍光ウイルスのおかげで、siRNAを標的とするsiRNAによるRSV発現の阻害は、インプDHタンパク質とを標的とし、容易に観察および測定することができる。これに対し、細胞タンパク質GAPDHに対してsiRNAをトランスフェクトした非標的siRNAまたは細胞をトランスフェクトしたコントロール細胞に対する強力なGFPシグナルを観察し、測定した。
同様にこれらのウイルスは抗ウイルス薬化合物によるRSV増殖の阻害の容易な観察を可能にした。HEp-2感染細胞における蛍光タンパク質M2-1を追跡すると、IB関連顆粒とIB関連顆粒が非常に動的な構造として示された。IBは、より大きな球状の含み物を形成するために融合し、形成することができる移動式および球形構造として観察された。
IB関連顆粒は、成長した小さなIB関連顆粒の形成と連続的な組み立て分解サイクルを受け、大きなIB関連顆粒に融合し、その後消失した。微結晶セルロースオーバーレイを用いたRSVのプラーク滴定のプロトコルは、他の細胞および/または他のウイルスに容易に適応され得る。それは、微結晶セルロースの濃度を調整する必要があります。
