El uso de virus recombinantes es una tecnología poderosa tanto para descifrar los mecanismos de replicación viral como para proporcionar plataformas de desarrollo para las vacunas. Del mismo modo, la generación de stock viral de buena calidad es crucial para cada estudio viral desde la investigación más fundamental hasta los estudios aplicados. El rescate de virus recombinantes, la cosecha óptima, la congelación y la valoración de las poblaciones de RSV son métodos críticos para todos los estudios virológicos.
Pueden considerarse tradicionales, pero siguen siendo delicadas y requieren conocimientos especializados específicos. El día antes de la transfección, suspenda las células BSR-T7/5 en un medio completo a 0,5 millones de células por mililitro de concentración. Distribuir dos mililitros de la suspensión celular por pozo en una placa de seis pozos.
Incubar la placa a 37 grados celsius en 5% dióxido de carbono hasta que alcancen 80-90% de confluencia al día siguiente. Para rescatar cada virus, primero mezcle vectores genéticos inversos descongelados en un tubo y, a continuación, proceda a la transfección, siguiendo el protocolo del fabricante del reactivo de transfección. A continuación, añada 250 microlitros del medio sérico reducido a los vectores mixtos.
En otro tubo, diluir 10 microlitros de este reactivo de transfección en 250 microlitros del medio sérico reducido. Vórtice suavemente ambos tubos y espere cinco minutos. Mezclar el contenido de ambos tubos y esperar 20 minutos a temperatura ambiente.
Mientras tanto, enjuague las células BSR-T7/5 con un mililitro del medio sérico reducido y distribuya 1,5 mililitros de antibióticos medios esenciales mínimos libres complementados con 10% de suero de ternera fetal por pozo. Si es necesario, incubar a 37 grados centígrados en un 5% de ambiente de dióxido de carbono. Después de la incubación de 20 minutos, agregue 500 microlitros de la mezcla de transfección en cada poción.
Incubar las células a 37 grados centígrados en un entorno de dióxido de carbono del 5% durante tres días. Para monitorear la eficiencia de rescate, observe la fluorescencia GFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido a un aumento de 20 veces una vez al día. En el tercer día de transfección, células de arañazos en cada pocópta de la placa transfectada BSR-T7/5 de seis pocillos.
Transfiera las células y el sobrenadante de cada pozo en un tubo estéril de microcentrífuga de dos mililitros. Para liberar el virus rescatado de las membranas celulares, vórtice cada tubo vigorosamente durante al menos 30 segundos. Para la primera amplificación de los virus rescatados, primero retire el medio de cultivo de la placa HEp-2 sembrada el día anterior, luego agregue rápidamente 500 microlitros por pozo de la nueva suspensión viral de paso cero.
Coloque la placa HEp-2 a 37 grados Celsius en un balancín de sierra para una agitación suave durante dos horas. Para producir el primer paso de los virus rescatados, deseche 500 microlitros del inóculo y añada dos mililitros de MEM con 2%FCS. Incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante tres días.
Para controlar la infección bajo un microscopio de fluorescencia invertido a un aumento de 20X, observe la fluorescencia GFP de las células HEp-2 infectadas con la suspensión de paso cero una vez al día. Bajo un microscopio de campo brillante, observe la aparición de una pequeña sinictia y desprendimiento celular, que refleja el efecto citopático del VHS. Para amplificar los virus rescatados, primero diluya la suspensión viral del MEM libre de FCS para obtener una suspensión de tres mililitros a 50.000 PFU por mililitro, luego retire el medio del matraz HEp-2.
Agregue rápidamente la suspensión viral de tres mililitros e incubar el matraz a 37 grados Centígrados en un balancín de sierra para una agitación suave durante dos horas. A continuación, retire y deseche el inóculo y añada 15 mililitros de MEM con 2%FCS. Incubar a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono durante dos a cuatro días.
Para estimar el momento adecuado para cosechar los virus, compruebe la morfología celular y la fluorescencia de la GFP bajo un microscopio de fluorescencia invertido a un aumento de 20 veces. Tenga en cuenta que esto es generalmente cuando 50%a 80% de la capa celular HEp-2 se separa debido al efecto citopático del VHS que ocurre entre 48 y 72 horas después de la infección. A continuación, raspe todas las células usando un rascador de celdas.
Recoger las células y el sobrenadante juntos y transferirlos a un tubo centrífugo de 50 mililitros. Añadir 1/10 del volumen de la solución de conservación 10X RSV. Vórtice los tubos vigorosamente durante cinco segundos y centrifugar durante cinco minutos a 200 veces g para aclarar la suspensión.
Transfiera el sobrenadante a un tubo de 50 mililitros. Vortex brevemente y aliquot la suspensión en tubos criogénicos etiquetados con etiquetas resistentes al alcohol. Sumerja el tubo en alcohol preenfriado, menos 80 grados centígrados durante al menos una hora y guárdelo a menos 80 grados centígrados.
Para realizar un ensayo de valoración de placa, primero haga 2X medio esencial mínimo diluyendo comercial 10X MEM con agua estéril y añadiendo L-glutamina, 1.000 unidades por penicilina mililitro, y un miligramo por estreptomicina mililitro. Agitar la dilución vigorosamente y almacenarla en cuatro grados Celsius, luego añadir 900 microlitros del MEM libre de FCS a seis tubos. Descongelar las alícuotas del virus y vórtice vigorosamente durante cinco segundos.
Para hacer diluciones en serie, primero agregue 100 microlitros del virus a 900 microlitros del medio en el primer tubo. Coloque la tapa en el tubo y mezcle su contenido por vórtice durante unos segundos, luego agregue 100 microlitros de la primera dilución a 900 microlitros del medio en el segundo tubo. Coloque la tapa en el tubo y el vórtice.
Repita este procedimiento hasta el sexto tubo. Escriba el nombre del virus y las diluciones completas en las placas HEp-2 de 12 pocillos. Agregue una marca para que coincida con la placa y su cubierta, ya que pueden separarse durante la tinción.
Retire el medio de las placas y distribuya 400 microlitros de una dilución por pozo. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante dos horas para la adsorción del virus. Durante la adsorción del virus, preparar la superposición de celulosa microcristalina ajustando primero el pH del MEM 2X a alrededor de 7.2 con una solución estéril de bicarbonato de sodio en 7.5%después del indicador de color.
Para obtener 100 mililitros de la superposición, añadir 10 mililitros de 2X MEM, 10 mililitros de 2.4%suspensión de celulosa monocristalina, y 80 mililitros del MEM complementados con 2%FCS y mezclar vigorosamente. Al final de la incubación de dos horas, añadir dos a tres mililitros de la superposición a cada pocillo de las placas de 12 pocillos sin quitar el inóculo. Incubar la placa a 37 grados centígrados en un 5% de dióxido de carbono durante seis días.
Para manchar las células con solución violeta cristalina, primero agita suavemente las placas para quitar la superposición de celulosa microcristalina. Retire los sobrenadantes y lave las células dos veces con 1X PBS, luego agregue uno a dos mililitros de la solución violeta cristalina y espere de 10 a 15 minutos. Retire la solución, que se puede reutilizar para la posterior tinción de placas.
Finalmente calcular los títulos del virus como una fracción del número de placas visibles en los pocillos de las placas secas y el volumen del inóculo y la dilución. Realizar un ensayo de placa en el control negativo, trans infectado con sólo los plásmidos de expresión de N, P, L y M2-1 no reveló ninguna placa en la dilución más baja. Se esperaba que los títulos obtenidos de las células trans infectadas estuvieran por encima de 100 PFU por mililitro si el rescate era eficiente.
Los títulos aumentaron sobre los pasajes para llegar a un millón a 10 millones de PFU por mililitro en el pasaje uno o dos. Gracias a estos virus fluorescentes, la inhibición de la expresión del RSV por siRNA dirigida a la proteína N y la proteína celular IMPDH se puede observar y medir fácilmente. Por el contrario, se observó y midió una señal GFP fuerte en las células de control trans infectadas con siRNA no focaliz reducida o células transfectadas con siRNA contra la proteína celular GAPDH.
Del mismo modo, estos virus permitieron una fácil observación de la inhibición de la multiplicación del VHS por un compuesto antiviral. El seguimiento de la proteína fluorescente M2-1 en células infectadas por HEp-2 mostró IBs y gránulos asociados al IB como estructuras muy dinámicas. Los IB se observaron como estructuras móviles y esféricas capaces de fusionarse y formar inclusiones esféricas más grandes.
Los gránulos asociados al IB se sometieron a ciclos continuos de desmontaje del ensamblaje con la formación de pequeños gránulos asociados al IB que crecieron, se fusionaron en grandes gránulos asociados al IB y luego desaparecieron. El protocolo de valoración de la placa del RSV mediante superposición de celulosa microcristalina puede adaptarse fácilmente a otras células y/u otros virus. Será necesario ajustar la concentración de la celulosa microcristalina.
