趋化梯度多细胞响应的三维分析

在体外培养的简化的2D培养物与3D组织样环境的差异增加了对3D系统的兴趣，以表示活组织的空间和化学复杂性。制造过程不需要设施或光刻技术。但是，3D PDMS 器件包括 3D 生理环境应用所需的矢量。

对于中流体器件制备，使用适当的三维计算机辅助设计软件程序为聚二甲基硅氧烷或PDMS器件设计模具的面罩，并使用带热抗性树脂的立体光刻设备打印模具。当模具准备就绪时，将每个模具的三毫升 PDMS 单体溶液与固化剂以 10 比 1 的比例大致混合，并使用真空在真空干燥器中解气一小时。在干燥结束时，使用一块胶带清除模具表面的任何灰尘，并小心地用脱气的 PDMS 溶液填充模具。

接下来，在 80 摄氏度下固化 PDMS 两个小时，然后让模具在室温下冷却。当模具冷却到触摸时，使用刀片切割模具和 PDMS 之间的边界，并小心地从模具中剥离 PDMS。修剪 PDMS 以适合 22 由 22 毫米的盖玻片，并在入口打孔。

使用低绒组织和 70% 乙醇，擦拭设备和盖玻片，然后用新的胶带涂抹设备，以去除任何大的灰尘颗粒。然后，在 121 摄氏度下将 PDMS 设备和盖玻片进行 <3>00，8 分钟潮湿，15 分钟干燥，然后用冠状放电枪将部分底部表面处理 5 分钟，然后用组织培养罩将部件粘合在一起。要加载设备，首先在适当体积的生长介质中重新暂停感兴趣的细胞，并辅以 1% 青霉素和链霉素和 1% 胰岛素转移素-钚-x。

接下来混合50微升的乳腺细胞悬浮液与425微升新鲜准备的中和胶原蛋白溶液，并填补200微升移液器与胶原蛋白细胞悬浮液。通过入口将悬浮液注入 PDMS 设备，直到整个腔室充满，将设备在 37 摄氏度的培养箱中放入 5%的二氧化碳中一小时，以诱导凝胶，然后用生长介质填充两侧的储液罐，然后将设备返回到培养箱，直到共生成像。对于 3D 成像和定量，在共合显微镜上安装活细胞成像培养室，并分别将温度和二氧化碳预设为 37 摄氏度和 5%。

向成像室储液罐中加入水以加湿腔室，根据需要将湿巾放入腔室，并将 PDMS 设备放入腔室中。将表皮生长因子添加到其中一个储层中，作为梯度形成因子的来源，让另一个储层作为空间分级表皮生长因子分布发展的汇。然后设置 Z 堆栈的范围，覆盖感兴趣的器官的体积，然后开始成像。

在实验结束时，使用适当的图像分析程序来测量从器官延伸的分支的长度和角度或单个细胞的迁移。在硅和体外测试中，都显示细胞培养区形成稳定的线性表皮生长因子梯度，该梯度持续约两天，无需补充源或汇储层，这表明表皮生长因子（一种 6.4 千多吨蛋白）可以在相对较短的时间内在胶原蛋白凝胶内形成稳定的扩散梯度，如相对短的时间内所证明的。如果将表皮生长因子添加到线性梯度中，每毫升有 0.5 纳米摩尔，在空间均匀的 2.5 纳米摩尔表皮生长因子存在的情况下，乳腺器官形成多个分支，三天内无方向偏向。

但是，分支形成表现出显著的方向偏差。值得注意的是，间隙结抑制剂的加入抑制了器官对梯度的反应能力。胶原蛋白溶液的pH值对于凝胶和细胞的生存能力至关重要。

如果在混合之前未中和胶原蛋白，细胞活力将较低。这种方法可以扩展，以适应更真实的组织建模，并可以容纳血管网络形成从单个细胞在凝胶。