通过质量敏感颗粒跟踪，我们可以观察在脂质膜上扩散的单个生物分子，并实时量化其动力学，所有这些都完全无标记。由于不需要标签，因此不存在干扰生物分子动态行为的危险。这种方法的另一个优点是其质量灵敏度，这使我们能够确定膜结合的低聚态。
由于其多功能性，我们可以将这种方法应用于任何膜相关系统。特别是，它可用于研究配体诱导的受体复合物的形成。首先在PTFE支架中分配相同数量的显微镜载玻片。
将PTFE支架转移到烧杯中。加入超纯水，在室温下超声处理15分钟。使用镊子将支架转移到清洁烧杯中，并添加超纯异丙醇。
再次超声处理15分钟，然后再次用超纯水替换异丙醇，并将装有支架的烧杯超声处理15分钟。从烧杯中取出支架，并在稳定的氮气或压缩空气流下将支架中的显微镜载玻片吹干。将装有大型显微镜载玻片的干燥支架放入等离子体清洁器中并打开。
用铝箔包裹扁平纸板。将清洁的24毫米×24毫米显微镜载玻片铺在铝箔上，彼此之间有足够的距离。然后将双面胶带连接到载玻片的上边缘和下边缘。
用手术刀切除每个显微镜载玻片，使其可以从铝箔上取下。每张幻灯片的上下边缘应有双面胶带条纹。然后将载玻片与两个双面胶带条连接到水亲滑轨上。
这将在较小和较大的显微镜载玻片之间形成流路。在所需的反应缓冲液中将新鲜挤出的小单层囊泡或SUV稀释至最终浓度为每毫升0.4毫克。任选地，为了促进囊泡破裂，向囊泡悬浮液中加入两毫摩尔氯化钙。
将流动室安装到质量光度计载物台上。将25微升囊泡悬浮液冲洗到流动室中，并将腔室孵育两分钟，然后每次用200微升反应缓冲液重复洗涤流动室以除去未熔融的囊泡。一旦脂质膜没有未融合的囊泡，向样品室中加入50微升的目标蛋白质。
接下来在采集软件中设置成像条件，如视场大小、曝光时间、帧速率、采集时间等。自动调整对焦。如有必要，使用横向控制将视场移动到具有均匀膜的位置。
创建项目文件夹并开始录制影片。录制完成后，在采集软件提示的对话框中指定文件名。影片将作为 MP 文件自动保存到项目文件夹中，以供后续分析。
若要分析录制的视频，请启动 Jupyter 笔记本应用。在出现的文件夹列表中，导航到 MSPT 分析所在的位置。ipy笔记本文件被存储，然后单击该文件。
在Jupyter笔记本中，代码以单元格形式组织，可以逐步执行。单击单元格旁边的小“播放”按钮，或选择一个单元格，然后按 Shift Enter 执行该单元格。首先导入分析所需的所有包。
执行下一个单元格以启动文件提示。选择一个包含一个或多个要分析的MP视频文件的文件夹，然后按选择文件夹。所选文件的列表将打印在单元格下方。
要使用逐像素背景估计算法消除光的主要静态散射，请为参数模式选择连续中位数选项，并为滑动中位数窗口设置适当的长度。（可选）在背景删除后保存影片，方法是将save_processed_movies True“以将其用于粒子检测和轨迹链接。确保将并行 True 和 GPU False 设置为在 CPU 上进行处理，反之亦然，以便在 GPU 上进行处理。
粒子及其各自的位置在整个电影中被识别和定位。使用阈值参数调整粒子检测的灵敏度，该阈值参数用于通过图像二值化突出显示候选点。在名为“电影可视化”的单独笔记本中检查不同阈值参数对点检测灵敏度的影响。
ipy 笔记本。将影片加载到帧查看器后，使用阈值滑块调整粒子检测阈值并找到适当的设置。回到另一个笔记本，选择三个参数，使用Python包trackpy将连续帧中的粒子链接到轨迹中。
根据最大预期扩散速度设置粒子从一帧到下一帧的最大位移。选择粒子可能消失和重新出现的最大帧数，但仍被视为同一粒子。可以使用参数minimum_trajectory_length删除点太少的轨迹，以便更可靠地确定扩散系数。
通过执行来修复单元格中的所有参数。执行下一个单元格以使用所选参数分析所有选定的视频。每个处理步骤的进度条将显示在单元格下方。
这可能需要一段时间，具体取决于视频长度、参数设置和硬件。在下一步中，软件根据跳跃距离分布和均方位移分析确定上一节中发现的轨迹的扩散系数。首先指定影片frame_rate和pixel_size。
通过执行单元格来修复它们，然后运行下一个单元格并选择包含 trackpy 生成的所有 CSV 文件的父目录。找到的 CSV 文件的列表将打印在单元格下方。在下一个单元格中，为存储结果的 HDF5 容器选择一个名称并执行它。
最后执行单元格C.4以执行扩散分析。在单元格C.5中，输入与质量校准线参数的对比度，这意味着使用已知质量的样品确定的斜率和偏移，并执行它以将所有粒子对比度转换为分子质量。通过执行单元格 C.6 来评估膜上的表观颗粒密度，该单元格 C.6 根据检测到的颗粒返回中值，并将每帧期间的轨迹作为数据框中的附加列呈现。
要生成质量和扩散系数相关性的最终图，请执行单元格 D.1 以加载文件提示并指定包含 MSPT 结果的 HDF5 文件，然后从单个视频中选择要在单元格 D.2 中绘制的数据集，或者通过执行单元格 D.3 将来自多个视频的数据合并到单个数据帧中。在此示例中，由于所有视频都是相同样本的复制，因此数据集是池化的。最后，通过执行单元 D.4 绘制 2D 核密度。
如果满足，请指定一个位置，将绘图保存到单元格 D.5 中的 PDF 文件中并执行它。此处显示了在形成支撑脂质双层期间玻璃盖玻片的表面粗糙度，具有完整的支撑脂质双层以及在SLB上重建的示例性蛋白质的代表性图像。所有四个示例都以原生模式显示，可以在测量期间访问，也可以在基于中位数的背景删除后作为处理的比例图像显示。
通过将已知质量的生物分子通过生物素 - 链霉亲和素 - 生物素复合物附着到SLB上，可以实现将对比度转化为分子质量的校准。作为一种示例性策略，可以使用牛血清白蛋白，蛋白A，碱性磷酸酶和纤连蛋白的生物素化变体，它们与链霉亲和素结合，链霉亲和素本身与膜中含生物素的脂质结合。这些示例性大分子的日益明显的对比反映了各自生物素化标准品分子量的增加。
通过将对比直方图的每个峰分配给标准蛋白的低聚物状态的相应质量，揭示了对比度和质量之间的线性关系，并随后可用于分析未知的大分子系统。这里显示了四价链霉亲和素与生物素化醛缩酶或生物素修饰的山羊抗兔IgG抗体复合物的质量和扩散系数的2D核密度估计。代表性图像显示了四价链霉亲和素与生物素修饰醛缩酶或IgG复合物的确定的低聚物质量与预期分子量的比较。
使用MSPT，我们可以直接跟踪脂质膜上的生物分子，确定它们具有的质量，它们如何移动以及它们如何相互作用。我相信，这项技术将改变我们对膜上和膜上生物过程的理解。
