超分辨率结构化照明显微镜3D-SIM是一种创新技术，用于在孢子膜中对发芽受体簇的荧光测量器蛋白进行可视化。使用这些程序，可以实现细菌体定位和孢子内膜脂域的无与伦比的分辨率。这项技术将由博士生胡安·温和我们实验室的理学硕士学生雷蒙德·帕斯曼展示。

在开始手术之前，用一摩尔盐酸清洁高精度盖玻片，在轻轻摇动的水浴中清洁30分钟，随后在超纯1型水中清洗两到五分钟。第二次洗涤后，将盖玻片放在 100% 乙醇中约 3 分钟，然后干燥盖玻片并验证其清晰度。然后，用 70% 乙醇清洁玻璃显微镜滑动一分钟，然后让幻灯片干燥并验证其清晰度。

对于荧光微球和孢子成像，首先在 70 摄氏度加热块上预热两个幻灯片几秒钟，然后向其中一个幻灯片添加 70 摄氏度、65 微升的灭菌 2% agarose 液滴。将另一张幻灯片放在顶部，在幻灯片之间展开加糖。五分钟后，取出其中一个滑梯，将干的阿加罗斯切成一厘米的截面。

将 1 倍 10 添加到第八荧光微球或孢子中，将 0.4 微升无菌超纯 1 型水添加到 agarose 中，并使用盖玻片将贴片从幻灯片滑到盖玻片表面，将高精度盖玻片放在贴片上。然后，将 65 微升、1.5 到 1.6 厘米的 Gene Frame 固定到干滑上，将盖玻片放在框架上，关闭框架的所有角。对于样品的成像，请将幻灯片放在配备 100 倍油目标的结构化照明显微镜上，并专注于 100 纳米荧光微球。

调整 100 倍目标的校正环，直到获得对称点传播函数，以最大限度地减少图像的模糊，并选择具有大约 10 个圆形荧光微球的视场。在这种情况下，对指定的激发波长（561 和 488 纳米）应用光栅聚焦调整，作为图像分析软件的指南，然后使用传输光聚焦孢子。以 16 倍的平均模式捕获传输光图像，每个图像的曝光速度为 20 毫秒。

然后，利用 3D-SIM 照明模式捕获 3D 结构照明显微镜生荧光图像的孢子。要切片重建，请单击结构化照明板选项卡工作表上的 Param 以打开 N-SIM 切片重建窗口。按照建议的说明操作，然后单击相应的控件，将照明调制对比度设置为自动，将高分辨率噪声抑制设置为 1，将焦点模糊抑制设置为 0.05 作为起点。

然后，单击"重建切片"以重建图像，通过重建后显示的快速 Fourier 变换图像和重建分数来评估重建图像的质量。将高分辨率噪声从 0.1 调整为 5，将焦点模糊抑制从 0.01 调整到 0.5，直到获得最佳参数设置。然后，单击"应用"以应用更改。

单击"关闭"以关闭窗口。打开 FM4-64 染色 PS4150 孢子原始图像。然后，单击"重建切片"以执行切片重建，然后保存重建的图像。

要将 KGB80 宝石的 3D-SIM 原始图像转换为伪宽场图像，请左键单击 ImageJ SIMcheck 插件，然后选择原始数据 SI 和伪宽场。随机选择每个倒置传输图像中的大约 25 个孢子，以在荧光伪广场图像中进行后来的胚芽分析，直到选择大约 350 个孢子。然后，使用 ImageJ 评估每组孢子所表达的每个荧光信号的最大强度以及每个 3D 孢子图像的集成强度。

要分析 KGB80 胚芽体的伪广场图像，请使用 7 个堆栈的均值作为 KGB80 孢子的集成信号强度。然后，使用相同的设置对PS4150背景菌株进行成像，确定背景强度，并在与背景清晰区分时将单个KGB80孢子中的荧光斑视为细菌性源。在这个具有代表性的实验中，GerD-GFP荧光孢子的两个 foci 出现在不同的堆栈中，在综合 Z3 堆栈中观察到三个总的 GerD-GFP foci。

在这里，观察到孢子中只有一个GerD-GFP焦点的孢子。总共有大约40%至50%的孢子分别有两个或一个GerD-GFP和GerKB-mCherry簇。虽然GerD-GFP支架蛋白的集成强度不同，不同人群的GerKB-mCherry综合强度大致相同。

当孢子具有多个源时，GerD-GFP和GerKB-mCherry foci的最大荧光强度趋于降低，所有光点的最大荧光度（即细菌性源）高于PS4150孢子的最大自动荧光。值得注意的是，与细菌性叶类相似的更亮的FM4-64点出现在完整和装饰的PS4150孢子中，表明这些更亮的FM4-64点可能参与内膜中细菌性蛋白质的聚类。将孢子添加到红糖中，并将阿加罗斯放入框架中，需要持续、小心地为这些迷你材料进行流体运动。

将KGB80细菌体3D-SIM原始图像转换为伪广场图像及其解释需要有关孢子生物学的专业知识。我们的结构化照明显微镜程序可应用于不同细菌或其他波段材料中低丰性蛋白质或暗荧光测量仪的成像。现在可以使用双标记程序来研究细菌性体的组织，以评估杆菌发芽蛋白和特定膜域的共同定位。