מיקרוסקופ תאורה מובנה ברזולוציית-על, 3D-SIM, היא טכניקה חדשנית להדמיה של חלבוני כתב פלואורסצנטיים של אשכולות קולטני נביטה בממברנות נבגים. באמצעות הליכים אלה, פתרון ללא תחרות של לוקליזציה נביט ונבגים פנימיים השומנים ניתן להשיג. הטכניקה תוכח על ידי דוקטורנט חואן וון וסטודנט לתואר שני במדעים ריימונד פסקמן מהמעבדה שלנו.
לפני תחילת ההליך, לנקות כיסויים דיוק גבוה עם חומצה הידרוכלורית טוחה אחת במשך 30 דקות באמבט מים רועד בעדינות, ואחריו שתיים, חמש דקות שוטף במים מסוג אולטרה 1. לאחר הכביסה השנייה, מניחים את הכיסויים ב 100% אתנול במשך כשלוש דקות לפני ייבוש כיסויים ואימות הבהירות שלהם. לאחר מכן, מיקרוסקופ זכוכית נקי מחליק עם 70% אתנול למשך דקה אחת לפני שהוא מאפשר לשקופיות להתייבש ולאמת את הבהירות שלהן.
להדמיית מיקרוספרה ונבגים פלואורסצנטיים, תחילה שתי שקופיות חמות מראש על בלוק חימום של 70 מעלות צלזיוס למשך מספר שניות לפני הוספת צלזיוס של 70 מעלות, טיפה של 65 מיקרוליטר של 2% מעוקרות על אחת השקופיות. מקם את השקופית האחרת למעלה כדי להפיץ את ההתעוררות בין השקופיות. לאחר חמש דקות, להסיר את אחת השקופיות לחתוך את אגת מיובש לתוך קטע אחד על אחד סנטימטר.
הוסיפו 10 פעמים למיקרוספרות או הנבגים הפלורסנטיים השמיניים ב-0.4 מיקרוליטרים של מים סטריליים ואל-יציבים מסוג 1 לאגורוז, והנחו כיסוי בדיוק גבוה על התיקון באמצעות המכסה כדי להחליק את הטלאי מהמגלשה אל משטח הכיסוי. לאחר מכן, תקן מסגרת ג'ין של 65 מיקרוליטר, 1.5 על 1.6 ס"מ על שקופית מיובשת, והצב את הכיסוי על המסגרת, וסגור את כל פינות המסגרת. להדמיה של הדגימות, מקם את השקופית על מיקרוסקופ תאורה מובנה המצויד במטרה של שמן 100X, והתמקד במיקרוספרות הפלואורסצנטיות של 100 ננומטר.
כוונן את טבעת התיקון על המטרה 100x עד שתתקבל פונקציית התפשטות נקודה סימטרית כדי למזער את טשטוש התמונות, ובחר שדה ראייה עם כ- 10 מיקרוספרות פלואורסצנטיות עגולות. החל התאמת מיקוד צורם עבור אורכי גל העירור המיועדים, במקרה זה, 561 ו 488 ננומטר, כמדריך עבור תוכנת ניתוח תמונה לפני התמקדות נבגים עם אור השידור. לכוד תמונת אור שידור במצב ממוצע של פי 16 עם חשיפות של 20 אלפיות שנייה לכל תמונה.
לאחר מכן, לכוד תמונות פלואורסצנטיות גולמיות של מיקרוסקופ תאורה תלת-מימדי של הנבגים באמצעות מצב תאורת 3D-SIM. לשחזור פרוסה, לחצו על Param בגיליון לשונית משטח התאורה מובנה לפתיחת החלון 'שחזור פרוסת N-SIM'. בצע את ההוראות המוצעות, ולחץ על הפקדים המתאימים כדי להגדיר את ניגודיות אפנון התאורה לאוטואי, את דיכוי הרעש ברזולוציה גבוהה לאחד, ואת הדיכוי טשטוש מחוץ למוקד ל 0.05 כנקודות התחלה.
לאחר מכן, לחצו על 'בנייה מחדש של פרוסה' כדי לבנות מחדש את התמונה ולהעריך את איכות התמונות ששוחזרו באמצעות התמונות המהירות שעברו שינוי צורה של פורייה וציון השחזור המוצגים לאחר השחזור. כוונן את הרעש ברזולוציה גבוהה מ- 0.1 לחמישה ואת ההעלמה של טשטוש המוקד מ- 0.01 ל- 0.5 עד להגדרות הפרמטרים הטובות ביותר. לאחר מכן, לחץ על החל כדי להחיל את השינויים.
לחץ על סגור כדי לסגור את החלון. פתח תמונה גולמית של נבגים מוכתמים FM4-64 PS4150. לאחר מכן, לחצו על 'בנייה מחדש של פרוסה' לביצוע שחזור הפרוסה, ושמור את התמונה ששוחזרה.
כדי להמיר את התמונות הגולמיות 3D-SIM של geminosome KGB80 לתוך תמונות פסאודו רחב שדה, לחץ שמאלה על תוסף ImageJ SIMcheck ובחר SI נתונים גולמיים ו Pseudo Widefield. בחר באופן אקראי כ-25 נבגים בכל תמונת שידור הפוכה לניתוח נבטים מאוחר יותר בתמונות הפסאודו-רחבות-שדה הפלואורסצנטיות עד שנבחרו כ-350 נבגים. לאחר מכן, השתמש ב- ImageJ כדי להעריך את העוצמה המרבית עבור כל אות פלואורסצנטי המובע על ידי כל קבוצת נבגים ואת העוצמה המשולבת של כל תמונת נבג תלת-מימדית.
כדי לנתח את התמונות הפסאודו-רחבות של החיידק KGB80, השתמש בערך העוצמה המשולב הממוצע של שבע ערימות כעוצמת האות המשולבת של נבג הקג"ב80. לאחר מכן, לקבוע את התעצמות הרקע על ידי הדמיה זן הרקע PS4150 באמצעות הגדרות זהות, ולהתייחס כתמים פלואורסצנטיים נבגים קג"ב80 בודדים כמו מוקדי נביט כאשר הם נבדלים בבירור מן הרקע. בניסוי מייצג זה, שני מוקדים של נבגים פלואורסצנטיים GerD-GFP הופיעו בערימות שונות עם שלושה מוקדי GerD-GFP סה"כ שנצפו בערימה Z3 קומפוזיטיבי.
כאן נצפה נבג עם מוקד אחד בלבד של GerD-GFP. בסך הכל, בסביבות 40 עד 50% מהנבגים היו שניים או אחד GerD-GFP ו GerKB-mCherry אשכול, בהתאמה. בעוד שהעוצמה המשולבת של חלבון הפיגומים GerD-GFP הייתה שונה בין אוכלוסיות שונות, העוצמה המשולבת של GerKB-mCherry הייתה בערך אותו הדבר באוכלוסיות שונות.
כאשר לנבג היו מוקדים מרובים, עוצמת הפלואורסצנטיות המרבית של Foci GerD-GFP ו- GerKB-mCherry נטו לרדת, והפלואורסצנטיות המרבית של כל הנקודות הבהירות, הנחשבות למוקד הנביטה, הייתה גבוהה יותר מהפלואורסצנטיות האוטומטית המרבית של נבגים PS4150. יש לציין, כתמי FM4-64 בהירים יותר הדומים למסוקים נביטיים מופיעים בשני נבגי PS4150 שלמים ומפענחים, מה שמרמז על כך שנקודות FM4-64 בהירות אלה עשויות להיות מעורבות בקיבוץ חלבונים נביטיים בממברנה הפנימית. הוספת נבגים אגרוז והצבת אגרוז לתוך המסגרת דורש תנועה נוזלית רציפה וזהיר עבור חומרים אלה minis.
ההמרה של תמונות גולמיות 3D-SIM של החיידק KGB80 לתוך תמונות פסאודו רחב שדה ואת הפרשנות שלהם דורש ידע מומחה על ביולוגיה נבגים. ניתן ליישם את הליך המיקרוסקופיה של התאורה הבנויה שלנו על הדמיה של חלבונים בשפע נמוך או כתבי פלואורסצנטיות עמומים בחיידקים שונים או בחומרי רצועה אחרים. הארגון של germinosome כעת ניתן ללמוד באמצעות הליכי תיוג כפול כדי להעריך לוקליזציה שותף של חלבוני נביטת Bacillus ותחומי קרום ספציפיים.
