Die superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie 3D-SIM ist eine innovative Technik zur Visualisierung fluoreszierender Reporterproteine von Keimrezeptorclustern in Sporenmembranen. Mit diesen Verfahren, unübertroffene Auflösung der germinosome Lokalisation und Sporen innere Membran Lipid Domänen erreicht werden können. Die Technik wird von Doktorand Juan Wen und Master of Science Student Raymond Pasman von unserem Labor demonstriert werden.

Reinigen Sie vor Beginn des Verfahrens hochpräzise Abdeckungen mit ein-molaren Salzsäure für 30 Minuten in einem sanft schüttelnden Wasserbad, gefolgt von zwei, fünfminütigen Wärern in reinem Typ 1 Wasser. Nach der zweiten Wäsche die Deckellipsen etwa drei Minuten in 100%Ethanol geben, bevor Sie die Deckellipsen trocknen und ihre Klarheit überprüfen. Anschließend gleitet das Glasmikroskop eine Minute lang mit 70% Ethanol, bevor die Dias trocknen und deren Klarheit überprüft wird.

Für die fluoreszierende Mikrosphäre und Sporenbildgebung werden zunächst zwei Dias auf einem 70-Grad-Celsius-Heizblock für einige Sekunden vorwärmen, bevor ein 70-Grad-Celsius-, 65-Mikroliter-Tröpfchen sterilisierter 2%Agarose auf einen der Dias hinzugefügt wird. Platzieren Sie die andere Folie oben, um die Agarose zwischen den Folien zu verteilen. Nach fünf Minuten eines der Dias entfernen und die getrocknete Agarose in einen Ein-mal-Ein-Zentimeter-Abschnitt schneiden.

Fügen Sie der Agarose ein mal 10 zu den achten fluoreszierenden Mikrosphären oder Sporen in 0,4 Mikroliter nsterilem, ultrareinem Typ-1-Wasser hinzu, und legen Sie einen hochpräzisen Deckelaufschlag auf den Patch, indem Sie den Deckelrutsch verwenden, um den Patch von der Rutsche auf die Deckslip-Oberfläche zu schieben. Fixieren Sie dann einen 65-Mikroliter, 1,5 mal 1,6-Zentimeter-Genrahmen auf einem getrockneten Schlitten, und legen Sie den Deckelrutsch auf den Rahmen, indem Sie alle Ecken des Rahmens schließen. Legen Sie den Dia für die Bildgebung der Proben auf ein strukturiertes Beleuchtungsmikroskop, das mit einem 100-fachen Ölobjektiv ausgestattet ist, und konzentrieren Sie sich auf die 100-Nanometer-Fluoreszenzmikrosphären.

Passen Sie den Korrekturring am 100x-Objektiv an, bis eine symmetrische Punktstreufunktion erhalten ist, um die Unschärfe der Bilder zu minimieren, und wählen Sie ein Sichtfeld mit ca. 10 runden fluoreszierenden Mikrosphären aus. Wenden Sie eine Gitterfokuseinstellung für die angegebenen Anregungswellenlängen, in diesem Fall 561 und 488 Nanometer, als Richtschnur für die Bildanalysesoftware an, bevor Sie sich mit dem Transmissionslicht auf die Sporen konzentrieren. Erfassen Sie ein Übertragungslichtbild im 16-fachen Durchschnittsmodus mit 20-Millisekunden-Belichtungen für jedes Bild.

Erfassen Sie dann mit dem 3D-SIM-Beleuchtungsmodus rohfluoreszierende Bilder der Sporen mit 3D-strukturiertem Beleuchtungsmikroskop. Für die Slice-Rekonstruktion klicken Sie auf Param auf dem Registerkartenblatt für strukturierte Beleuchtungspads, um das Fenster N-SIM Slice Reconstruction zu öffnen. Befolgen Sie die vorgeschlagenen Anweisungen, und klicken Sie auf die entsprechenden Steuerelemente, um den Kontrast zur Beleuchtungsmodulation auf Auto, die hochauflösende Rauschunterdrückung auf eine und die Ausblendungsunterdrückung auf 0,05 als Ausgangspunkt festzulegen.

Klicken Sie dann auf Slice rekonstruieren, um das Bild zu rekonstruieren und die Qualität der rekonstruierten Bilder anhand der schnellen Fourier-transformierten Bilder und der Rekonstruktionspartitur zu bewerten, die nach der Rekonstruktion angezeigt werden. Passen Sie das hochauflösende Rauschen von 0,1 bis fünf und die Ausblendungsunterdrückung von 0,01 bis 0,5 an, bis die besten Parametereinstellungen erreicht sind. Klicken Sie dann auf Anwenden, um die Änderungen anzuwenden.

Klicken Sie auf Schließen, um das Fenster zu schließen. Öffnen Sie ein FM4-64 gebeizt PS4150 Sporen Rohbild. Klicken Sie dann auf Slice rekonstruieren, um die Slice-Rekonstruktion auszuführen, und speichern Sie das rekonstruierte Bild.

Um die 3D-SIM-Rohbilder des KGB80-Geminosomes in Pseudo-Weitfeldbilder umzuwandeln, klicken Sie mit der linken Maustaste auf das ImageJ SIMcheck Plugin und wählen Raw Data SI und Pseudo Widefield aus. Wählen Sie zufällig etwa 25 Sporen in jedem invertierten Übertragungsbild für eine spätere Germinosomenanalyse in den fluoreszierenden Pseudo-Weitfeldbildern aus, bis etwa 350 Sporen ausgewählt wurden. Verwenden Sie dann ImageJ, um die maximale Intensität für jedes fluoreszierende Signal, das von jeder Gruppe von Sporen ausgedrückt wird, und die integrierte Intensität jedes 3D-Sporenbildes zu bewerten.

Um die Pseudo-Weitfeldbilder des KGB80 Germinosom zu analysieren, verwenden Sie den mittleren integrierten Intensitätswert von sieben Stapeln als integrierte Signalintensität der KGB80 Sporen. Bestimmen Sie dann die Hintergrundintensitäten, indem Sie die PS4150-Hintergrunddehnung mit identischen Einstellungen abbilden, und betrachten Sie die fluoreszierenden Flecken in einzelnen KGB80-Sporen als germinosome-Foci, wenn sie sich deutlich vom Hintergrund unterscheiden. In diesem repräsentativen Experiment traten zwei Brennpunkte der GerD-GFP-Fluoreszensporen in verschiedenen Stapeln auf, wobei im kompositiven Z3-Stack insgesamt drei GerD-GFP-Schwerpunkte beobachtet wurden.

Hier wurde eine Sporenmitenmit nur einem GerD-GFP-Schwerpunkt im Sporen beobachtet. Insgesamt hatten etwa 40 bis 50% der Sporen zwei bzw. einen GerD-GFP- bzw. GerKB-mCherry-Cluster. Während die integrierte Intensität des GerD-GFP Gerüstproteins zwischen verschiedenen Populationen unterschiedlich war, war die integrierte Intensität von GerKB-mCherry in verschiedenen Populationen ungefähr gleich.

Wenn die Sporen mehrere Brennpunkte hatten, verringerte sich die maximale Fluoreszenzintensität von GerD-GFP und GerKB-mCherry-Brennpunkten, und die maximale Fluoreszenz aller hellen Flecken, die als germinosome-foci angesehen wurden, war höher als die maximale Autofluoreszenz der PS4150-Sporen. Bemerkenswert ist, hellerFM4-64 Flecken ähnlich germinosome foci erscheinen sowohl in intakten und decoated PS4150 Sporen, was darauf hindeutet, dass diese helleren FM4-64 Flecken in der Clustering von Germinosomen Proteinen in der inneren Membran beteiligt sein könnte. Das Hinzufügen von Sporen zur Agarose und das Platzieren von Agarose in den Rahmen erfordert eine kontinuierliche und sorgfältige Flüssigkeitsbewegung für diese Minis-Materialien.

Die Umwandlung von 3D-SIM-Rohbildern des KGB80-Germinosomen in Pseudo-Weitfeldbilder und deren Interpretation erfordert Expertenwissen über Sporenbiologie. Unser strukturiertes Beleuchtungsmikroskopieverfahren kann auf die Bildgebung von schwach endizierten Proteinen oder dim Fluoreszenz-Reportern in verschiedenen Bakterien oder anderen Bandmaterialien angewendet werden. Die Organisation des Germinosom kann nun mit Doppeletikettierungsverfahren untersucht werden, um die Kolokalisierung von Bacillus-Keimproteinen und spezifischen Membrandomänen zu bewerten.