Süper çözünürlüklü yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu, 3D-SIM, spor membranlarda çimlenme reseptör kümelerinin floresan muhabir proteinlerin görselleştirilmesi için yenilikçi bir tekniktir. Bu işlemler kullanılarak, germiyotom lokalizasyonu ve spor iç membran lipid etki alanlarının eşsiz çözünürlüğü elde edilebilir. Bu teknik, laboratuvarımızdan doktora öğrencisi Juan Wen ve Fen Bilimleri Yüksek Lisans öğrencisi Raymond Pasman tarafından gösterilecek.
İşleme başlamadan önce, yüksek hassasiyetli kapakları tek azılı hidroklorik asitle 30 dakika boyunca hafifçe sallayarak su banyosunda temizleyin ve ardından ultrasaf Tip 1 suda iki, beş dakikalık yıkamalar uygulayın. İkinci yıkamadan sonra, kapakları kurutmadan ve berraklıklarını doğrulamadan önce yaklaşık üç dakika boyunca kapakları %100 etanole yerleştirin. Daha sonra, slaytların kurumasını ve berraklıklarını doğrulamadan önce bir dakika boyunca %70 etanolile temiz cam mikroskop kaydırakları.
Floresan mikrosfer ve spor görüntüleme için, 70 derecelik bir Santigrat Derece Lisan, sterilize 65 mikrolitrelik damlacık eklemeden önce birkaç saniye için 70 derecelik bir ısıtma bloğunda ilk ısıtma iki slayt, sterilize 2% agül slaytlar birine agarose. Slaytlar arasında agarose yaymak için üstüne diğer slayt yerleştirin. Beş dakika sonra, slaytlardan birini çıkarın ve kurutulmuş agarose bir-by-one-santimetre bölümü halinde kesti.
Agarose'a 0,4 mikrolitre steril, ultrasaf Tip 1 sudaki sekizinci floresan mikroküre veya sporlara bir kez 10 kat ekleyin ve yamanın kapağını kapak yüzeyine kaydırmak için kapak kaymasını kullanarak yamanın üzerine yüksek hassasiyetli bir kapak kayması yerleştirin. Ardından, 65 mikrolitre, 1,5 x 1,6 santimetrelik Gen Çerçevesini kurutulmuş bir kaydıraktan üzerine sabitleyin ve kapağı çerçevenin tüm köşelerini kapatarak çerçevenin üzerine yerleştirin. Örneklerin görüntülenmesi için, slaytı 100X yağ hedefiyle donatılmış yapılandırılmış bir aydınlatma mikroskobuna yerleştirin ve 100 nanometrelik floresan mikrokürelere odaklanın.
Görüntülerin bulanıklaşmasını en aza indirmek için simetrik nokta yayma fonksiyonu elde edilene kadar 100x hedefindeki düzeltme halkasını ayarlayın ve yaklaşık 10 yuvarlak floresan mikroküreiçeren bir görüş alanı seçin. İletim ışığı ile sporlara odaklanmadan önce görüntü analiz yazılımı için bir kılavuz olarak, bu durumda, 561 ve 488 nanometre, belirlenen uyarma dalga boyları için bir ızgara odak ayarı uygulayın. Her görüntü için 20 milisaniyelik pozlama ile 16x ortalama modunda bir iletim ışığı görüntüsü yakalayın.
Ardından, 3D SIM aydınlatma modu ile sporların 3D yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu ham floresan görüntülerini yakalayın. Dilim yeniden yapılandırma için, N-SIM Dilim Yeniden Yapılandırma penceresini açmak için yapılandırılmış aydınlatma pedi sekmesi sayfasında Param'ı tıklatın. Önerilen yönergeleri izleyin ve aydınlatma modülasyon kontrastını otomatik olarak ayarlamak için uygun denetimlere tıklayın, yüksek çözünürlüklü gürültü bastırma bire ve odak bulanıklığı bastırmanın başlangıç noktası olarak 0,05'e yükseltin.
Ardından, görüntüyü yeniden yapılandırmak ve yeniden yapılanma sonrasında görüntülenen hızlı Fourier dönüştürülmüş görüntüler ve yeniden yapılandırma puanıyla yeniden yapılandırılabilen görüntülerin kalitesini değerlendirmek için Dilim'i Yeniden Oluştur'u tıklatın. Yüksek çözünürlüklü gürültüyü 0,1'den beşe ve odak bulanıklığı bastırmayı 0,01'den 0,5'e en iyi parametre ayarları elde edilene kadar ayarlayın. Ardından, değişiklikleri uygulamak için Uygula'yı tıklatın.
Pencereyi kapatmak için Kapat'ı tıklatın. Fm4-64 lekeli PS4150 sporlar ham görüntü açın. Ardından, dilim rekonstrüksiyonu yürütmek ve yeniden oluşturulmuş görüntüyü kaydetmek için Dilim'i Yeniden Oluştur'u tıklatın.
KGB80 geminoomunun 3D-SIM ham görüntülerini sözde geniş alan görüntülerine dönüştürmek için ImageJ SIMcheck eklentisine sol tıklayın ve Raw Data SI ve Pseudo Widefield'ı seçin. Yaklaşık 350 spor seçilene kadar floresan psödo-widefield görüntülerde daha sonra germinozom analizi için her ters şanzıman görüntüsünde yaklaşık 25 spor seçin. Ardından, her bir spor grubu tarafından ifade edilen her floresan sinyal için maksimum yoğunluğu ve her 3D spor görüntüsünün entegre yoğunluğunu değerlendirmek için ImageJ'i kullanın.
KGB80 mikroburyumunun sözde geniş alan görüntülerini analiz etmek için, KGB80 sporunun entegre sinyal yoğunluğu olarak yedi yığının ortalama entegre yoğunluk değerini kullanın. Daha sonra, ps4150 arka plan gerilimini aynı ayarları kullanarak görüntüleyerek arka plan yoğunluklarını belirleyin ve tek tek KGB80 sporlarında floresan noktaları arka plandan açıkça ayırt edilebildiklerinde çimomnom odakları olarak kabul edin. Bu temsili deneyde, GerD-GFP floresan sporlarının iki odak ları, compozitif Z3 destesinde gözlenen üç toplam GerD-GFP foci ile farklı yığınlarda ortaya çıkmıştır.
Burada, sporda sadece bir GerD-GFP odak noktası olan bir spor gözlenmiştir. Toplamda, sporların yaklaşık %40-50'sinde sırasıyla iki veya bir GerD-GFP ve GerKB-mCherry kümesi vardı. GerD-GFP iskele proteininin entegre yoğunluğu farklı popülasyonlar arasında farklılık gösterirken, GerKB-mCherry'nin entegre yoğunluğu farklı popülasyonlarda hemen hemen aynıydı.
Spor birden fazla foci olduğunda, GerD-GFP ve GerKB-mCherry foci maksimum floresan yoğunluğu azaltmak eğilimindedir, ve tüm parlak noktalar maksimum floresans, çimonozom foci olarak kabul, PS4150 sporların maksimum otomatik floresan daha yüksekti. Özellikle, çimomnom foci benzer parlak FM4-64 noktalar hem bozulmamış ve decoated PS4150 sporlar görünür, bu parlak FM4-64 noktalar iç membran da germiyotom proteinlerin kümeleme dahil olabileceğini düşündürmektedir. Agarose sporlar ekleme ve çerçeve içine agarose yerleştirerek bu minis malzemeler için sürekli ve dikkatli sıvı hareketi gerektirir.
KGB80 mikrop lu mikropların 3D-SIM ham görüntülerinin sözde geniş alan görüntülerine dönüştürülmesi ve bunların yorumlanması spor biyolojisi konusunda uzman bilgi gerektirir. Yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu prosedürümüz, düşük miktarda protein veya loş floresan muhabirlerin farklı bakterilerde veya diğer bant malzemelerinde görüntülenmesinde uygulanabilir. Çimozom organizasyonu artık Bacillus çimlenme proteinleri ve belirli membran etki alanlarının birlikte lokalizasyonunu değerlendirmek için çift etiketleme prosedürleri kullanılarak incelenebilir.
