La microscopía de iluminación estructurada de superresoría, 3D-SIM, es una técnica innovadora para la visualización de proteínas fluorescentes reporteras de los clusters receptores de germinación en membranas esporas. Usando estos procedimientos, se puede lograr una resolución insuperable de la localización del germos y los dominios lipídicos de la membrana interna de las esporas. La técnica será demostrada por el estudiante de doctorado Juan Wen y el estudiante de Maestría en Ciencias Raymond Pasman de nuestro laboratorio.
Antes de comenzar el procedimiento, limpie los cubreobjetos de alta precisión con ácido clorhídrico de un molar durante 30 minutos en un baño de agua que agita suavemente, seguido de dos lavados de cinco minutos en agua ultrapura Tipo 1. Después del segundo lavado, coloque los cubreobjetos en 100% etanol durante unos tres minutos antes de secar los cubreobjetos y verificar su claridad. Luego, limpie los portaobjetos de vidrio con 70%etanol durante un minuto antes de permitir que las diapositivas se sequen y verificar su claridad.
Para la microesfera fluorescente y la imagen de esporas, primero precalenta dos diapositivas en un bloque de calentamiento Celsius de 70 grados durante unos segundos antes de agregar una gota de 70 grados Celsius, 65 microlitr de 2% de ágarrose esterilizada en uno de los portaobjetos. Coloque la otra diapositiva en la parte superior para extender la agarosa entre las diapositivas. Después de cinco minutos, retire uno de los portaobjetos y corte la agarosa seca en una sección de uno por uno centímetro.
Agregue una vez 10 a las octavas microesferas o esporas fluorescentes en 0,4 microlitros de agua estéril de tipo 1 ultrapura a la agarosa, y coloque un cubreobjetos de alta precisión sobre el parche utilizando el cubreobjetos para deslizar el parche fuera de la corredera sobre la superficie de la cubierta. A continuación, fije un marco genenador de 65 microlitro, 1,5 por 1,6 centímetros en un portaobjetos seco, y coloque el cubreobjetos en el marco, cerrando todas las esquinas del marco. Para obtener imágenes de las muestras, coloque la diapositiva en un microscopio de iluminación estructurado equipado con un objetivo de aceite 100X y concéntrese en las microesferas fluorescentes de 100 nanómetros.
Ajuste el anillo de corrección en el objetivo 100x hasta obtener una función de propagación de punto simétrico para minimizar el desenfoque de las imágenes y seleccione un campo de visión con aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique un ajuste de enfoque de rejilla para las longitudes de onda de excitación designadas, en este caso, 561 y 488 nanómetros, como guía para el software de análisis de imágenes antes de centrarse en las esporas con la luz de transmisión. Capture una imagen de luz de transmisión en el modo promedio de 16x con exposiciones de 20 milisegundos para cada imagen.
A continuación, capture imágenes fluorescentes crudas del microscopio de iluminación estructurada en 3D de las esporas con el modo de iluminación 3D-SIM. Para la reconstrucción de sectores, haga clic en Param en la hoja de pestañas del panel de iluminación estructurado para abrir la ventana Reconstrucción de sectores N-SIM. Siga las instrucciones sugeridas y haga clic en los controles adecuados para establecer el contraste de modulación de iluminación en automático, la supresión de ruido de alta resolución en uno y la supresión de desenfoque fuera del enfoque a 0,05 como puntos de partida.
A continuación, haga clic en Reconstruir sector para reconstruir la imagen y evaluar la calidad de las imágenes reconstruidas mediante las imágenes transformadas rápidamente por Fourier y la puntuación de reconstrucción que se muestran después de la reconstrucción. Ajuste el ruido de alta resolución de 0,1 a cinco y la supresión de desenfoque fuera del enfoque de 0,01 a 0,5 hasta obtener los mejores ajustes de parámetros. A continuación, haga clic en Aplicar para aplicar los cambios.
Haga clic en Cerrar para cerrar la ventana. Abre una imagen RAW de PS4150 esporas de PS4-64 manchada FM4-64. A continuación, haga clic en Reconstruir sector para ejecutar la reconstrucción del sector y guarde la imagen reconstruida.
Para convertir las imágenes sin procesar 3D-SIM del geminosoma KGB80 en imágenes pseudo-widefield, haga clic izquierdo en el plugin ImageJ SIMcheck y seleccione RAW Data SI y Pseudo Widefield. Seleccione aleatoriamente unas 25 esporas en cada imagen de transmisión invertida para un análisis de germinosomas posteriores en las imágenes fluorescentes de pseudo-ancho hasta que se hayan seleccionado aproximadamente 350 esporas. A continuación, utilice ImageJ para evaluar la intensidad máxima de cada señal fluorescente expresada por cada grupo de esporas y la intensidad integrada de cada imagen de espora 3D.
Para analizar las imágenes de pseudo-widefield del germinosoma KGB80, utilice el valor de intensidad integrado medio de siete pilas como la intensidad de señal integrada de la espora KGB80. A continuación, determinar las intensidades de fondo mediante la toma de imágenes de la cepa de fondo PS4150 utilizando ajustes idénticos, y considerar los puntos fluorescentes en las esporas individuales de KGB80 como focos de germosomas cuando son claramente distinguibles del fondo. En este experimento representativo, dos focos de las esporas fluoreste GerD-GFP aparecieron en diferentes pilas con tres focos totales de GerD-GFP observados en la pila com componetiva Z3.
Aquí, se observó una espora con un solo punto focal de GerD-GFP en la espora. En total, alrededor del 40 al 50% de las esporas tenían dos o un cluster De GerD-GFP y GerKB-mCherry, respectivamente. Si bien la intensidad integrada de la proteína de andamio GerD-GFP era diferente entre las diferentes poblaciones, la intensidad integrada de GerKB-mCherry era aproximadamente la misma en diferentes poblaciones.
Cuando la espora tenía múltiples focos, la intensidad máxima de fluorescencia de los focos de GerD-GFP y GerKB-mCherry tendía a disminuir, y la fluorescencia máxima de todos los puntos brillantes, considerados como los focos de germinosoma, era mayor que la autofluorescencia máxima de las esporas PS4150. En particular, las manchas FM4-64 más brillantes similares a los focos de germosoma aparecen en las esporas de PS4150 intactas y despofiadas, lo que sugiere que estas manchas FM4-64 más brillantes podrían estar involucradas en la agrupación de proteínas germosomas en la membrana interna. Añadir esporas a la agarosa y colocar la agarosa en el marco requiere un movimiento fluido continuo y cuidadoso para estos materiales minis.
La conversión de imágenes crudas 3D-SIM del germinos de la KGB80 en imágenes pseudo-widefield y su interpretación requiere conocimientos expertos sobre biología de esporas. Nuestro procedimiento de microscopía de iluminación estructurada se puede aplicar a la imagen de proteínas de baja abundancia o reporteros de fluorescencia tenue en diferentes bacterias u otros materiales de banda. La organización del germinosoma ahora se puede estudiar utilizando procedimientos de etiquetado doble para evaluar la co-localización de proteínas de germinación de Bacillus y dominios de membrana específicos.
