Microscopia de iluminação estruturada de super resolução, 3D-SIM, é uma técnica inovadora para a visualização de proteínas fluorescentes de aglomerados receptores de germinação em membranas esporos. Utilizando esses procedimentos, pode-se alcançar a resolução insuperável da localização germinos e dos domínios lipídudos da membrana interna. A técnica será demonstrada pelo doutorando Juan Wen e pelo estudante de Mestrado em Ciências Raymond Pasman do nosso laboratório.
Antes de iniciar o procedimento, limpe as tampas de alta precisão com ácido clorídrico de um molar por 30 minutos em um banho de água suavemente agitado, seguido por duas lavagens de cinco minutos em água ultrapura tipo 1. Após a segunda lavagem, coloque as tampas em 100% de etanol por cerca de três minutos antes de secar as tampas e verificar sua clareza. Em seguida, limpe os slides do microscópio de vidro com 70% de etanol por um minuto antes de permitir que os slides sequem e verifiquem sua clareza.
Para microesfera fluorescente e imagens de esporos, primeiro pré-aqueça dois slides em um bloco de aquecimento Celsius de 70 graus por alguns segundos antes de adicionar uma gotícula Celsius de 70 graus, 65-microliter de 2% esterilizada em um dos slides. Coloque o outro slide em cima para espalhar a ágarose entre os slides. Após cinco minutos, remova um dos slides e corte a agarose seca em uma seção de um por um centímetro.
Adicione uma vez 10 às oitavas microesferas fluorescentes ou esporos em 0,4 microliters de água estéril e ultrapura tipo 1 à ágarose, e coloque uma mancha de alta precisão no patch usando a mancha para deslizar o remendo para fora da superfície do deslizamento. Em seguida, fixe um quadro genético de 65 microliter, 1,5 por 1,6 centímetros em um slide seco e coloque a mancha na moldura, fechando todos os cantos do quadro. Para a imagem das amostras, coloque o slide em um microscópio de iluminação estruturado equipado com um objetivo de óleo de 100X e foque nas microesferas fluorescentes de 100 nanômetros.
Ajuste o anel de correção no objetivo de 100x até que uma função de propagação de ponto simétrico seja obtida para minimizar o desfoque das imagens e selecione um campo de visão com aproximadamente 10 microesferas fluorescentes redondas. Aplique um ajuste de foco de grade para os comprimentos de onda de excitação designados, neste caso, 561 e 488 nanômetros, como guia para o software de análise de imagem antes de focar nos esporos com a luz de transmissão. Capture uma imagem de luz de transmissão no modo médio de 16x com exposições de 20 milissegundos para cada imagem.
Em seguida, capture imagens fluorescentes brutas do microscópio de iluminação estruturada em 3D dos esporos com o modo de iluminação 3D-SIM. Para reconstrução de fatias, clique em Param na folha de guia de iluminação estruturada para abrir a janela de reconstrução de fatias N-SIM. Siga as instruções sugeridas e clique nos controles apropriados para definir o contraste de modulação de iluminação para auto, a supressão de ruído de alta resolução para um e a supressão de desfoque fora do foco para 0,05 como pontos de partida.
Em seguida, clique em Reconstruir fatia para reconstruir a imagem e avaliar a qualidade das imagens reconstruídas pelas imagens rápidas transformadas em Fourier e escore de reconstrução que são exibidas após a reconstrução. Ajuste o ruído de alta resolução de 0,1 para cinco e a supressão de desfoque fora do foco de 0,01 para 0,5 até que as melhores configurações do parâmetro sejam obtidas. Em seguida, clique em Aplicar para aplicar as alterações.
Clique em Fechar a janela. Abra uma imagem bruta de esporos PS4150 manchados FM4-64. Em seguida, clique em Reconstruir fatia para executar a reconstrução da fatia e salvar a imagem reconstruída.
Para converter as imagens brutas 3D-SIM do geminosome KGB80 em imagens pseudo-widefield, clique à esquerda no plugin ImageJ SIMcheck e selecione Raw Data SI e Pseudo Widefield. Selecione aleatoriamente cerca de 25 esporos em cada imagem de transmissão invertida para uma análise germinosa posterior nas imagens de pseudo-widefield fluorescentes até que aproximadamente 350 esporos tenham sido selecionados. Em seguida, use ImageJ para avaliar a intensidade máxima para cada sinal fluorescente expresso por cada grupo de esporos e a intensidade integrada de cada imagem de esporo 3D.
Para analisar as imagens pseudo-widefield do germinosomo KGB80, use o valor médio de intensidade integrada de sete pilhas como a intensidade de sinal integrado do esporo KGB80. Em seguida, determine as intensidades de fundo por imagem da cepa de fundo PS4150 usando configurações idênticas, e considere os pontos fluorescentes em esporos individuais KGB80 como focos germinos quando eles são claramente distinguíveis do fundo. Neste experimento representativo, dois focos dos esporos fluorescentes GerD-GFP apareceram em pilhas diferentes com três focos totais gerd-GFP observados na pilha z3 compositiva.
Aqui, observou-se um esporo com apenas um ponto focal GerD-GFP no esporo. No total, cerca de 40 a 50% dos esporos tinham dois ou um aglomerado GerD-GFP e GerKB-mCherry, respectivamente. Embora a intensidade integrada da proteína do andaime GerD-GFP fosse diferente entre diferentes populações, a intensidade integrada do GerKB-mCherry era quase a mesma em diferentes populações.
Quando o esporo tinha múltiplos focos, a intensidade máxima de fluorescência dos focos GerD-GFP e GerKB-mCherry tendia a diminuir, e a fluorescência máxima de todos os pontos brilhantes, considerados como os focos germinosos, era maior do que a auto-fluorescência máxima dos esporos PS4150. Notavelmente, manchas FM4-64 mais brilhantes semelhantes aos focos germinos aparecem em esporos PS4150 intactos e revestidos, sugerindo que esses pontos FM4-64 mais brilhantes podem estar envolvidos no agrupamento de proteínas germinosas na membrana interna. Adicionar esporos à ágarose e colocar agarose no quadro requer um movimento de fluido contínuo e cuidadoso para esses materiais minis.
A conversão de imagens brutas 3D-SIM do germinosomo KGB80 em imagens pseudo-widefield e sua interpretação requer conhecimento especializado sobre biologia de esporos. Nosso procedimento estruturado de microscopia de iluminação pode ser aplicado à imagem de proteínas de baixa abundância ou repórteres de fluorescência fraca em diferentes bactérias ou outros materiais de banda. A organização do germinos pode agora ser estudada utilizando procedimentos de rotulagem dupla para avaliar a co-localização de proteínas de germinação bacilo e domínios específicos da membrana.
