超解像構造照明顕微鏡、3D-SIMは、胞毛膜における発芽受容体クラスターの蛍光レポータータンパク質の可視化のための革新的な技術です。これらの手順を用いて、発芽性局在および胞毛内膜脂質ドメインの卓越した分解能が達成できる。この技術は、博士課程の学生フアン・ウェンと私たちの研究室の科学修士レイモンド・パスマンによって実証されます。
手順を開始する前に、穏やかに揺れる水浴で30分間、1モル塩酸を含む高精度のカバーリップを洗浄し、続いて超純粋なタイプ1水で2、5分の洗浄を行います。2回目の洗浄後、カバーリップを約3分間100%エタノールに入れてから、カバーリップを乾燥させて透明度を確認します。その後、きれいなガラス顕微鏡は、スライドを乾燥させ、その明瞭さを検証する前に、1分間70%エタノールでスライドします。
蛍光微小球および胞子イメージングの場合、最初のプレウォーム2スライドは、70°Cの加熱ブロック上で数秒間、70度の摂氏65マイクロリットルの液滴をスライドの1つに添加した。他のスライドを上に置き、スライド間にアガロースを広げます。5分後、スライドの1つを取り出し、乾燥アガロースを1センチのセクションに切ります。
8番目の蛍光微小球または胞子に0.4マイクロリットルの無菌、超純粋なタイプ1水を1回10回加え、カバースリップを使用してパッチに高精度のカバースリップを置き、スライドのパッチをカバースリップ表面にスライドさせます。その後、65マイクロリットル、1.5 x 1.6センチメートルのジーンフレームを乾燥スライドに固定し、カバースリップをフレームに置き、フレームのすべての角を閉じます。サンプルのイメージングのために、スライドを100Xの油性目的を備えた構造化された照明顕微鏡に置き、100ナノメートルの蛍光微小球に焦点を当てます。
画像のぼかしを最小限に抑える対称点広がり関数が得られるまで、100xの目的で補正リングを調整し、約10の丸い蛍光微小球を有する視野を選択します。指定された励起波長(この場合は561および488ナノメートル)に対してグレーティングフォーカス調整を適用し、透過光で胞子に焦点を当てる前に画像解析ソフトウェアのガイドとして適用する。各画像に対して 20 ミリ秒の露出を持つ 16x 平均モードで、透過光画像をキャプチャします。
次に、3D-SIM照明モードで胞子の蛍光画像を生で3D構造の照明顕微鏡を撮影します。スライスの再構成のために、構造化照明パッドタブシートの[Param]をクリックして、N-SIMスライス再構築ウィンドウを開きます。推奨される指示に従い、適切なコントロールをクリックして、照明変調コントラストを auto に設定し、高解像度ノイズ抑制を 1 に設定し、フォーカスブラーの非表示を開始点として 0.05 に設定します。
次に、[スライスの再構築] をクリックしてイメージを再構築し、再構築後に表示される高速フーリエ変換画像と再構築スコアによって、再構築された画像の品質を評価します。0.1 から 5 までの高解像度ノイズを調整し、フォーカスブラーの除去を 0.01 から 0.5 に調整して、最適なパラメータ設定を取得します。次に、[適用] をクリックして変更を適用します。
[閉じる] をクリックしてウィンドウを閉じます。FM4-64染色PS4150胞子の生画像を開きます。次に、[スライスの再構築] をクリックしてスライスの再構築を実行し、再構築したイメージを保存します。
KGB80 geminosome の 3D-SIM 生画像を疑似ワイドフィールド画像に変換するには、ImageJ SIMcheck プラグインを左クリックして、生データ SI と疑似ワイドフィールドを選択します。蛍光擬広視野画像での発芽分析のために、各反転透過画像で約25個の胞子をランダムに選択し、約350個の胞子が選択された。次にImageJを使用して、各胞子群で表される蛍光シグナルの最大強度と、各3D胞子像の積分強度を評価します。
KGB80の生殖細胞の擬似広視野画像を解析するには、7つのスタックの平均積分強度値をKGB80胞毛の統合信号強度として使用する。次に、同一の設定を用いてPS4150バックグラウンド株を画像化して背景強度を決定し、個々のKGB80胞子の蛍光スポットを、背景と明確に区別できる場合は発芽性病巣とみなします。この代表的な実験では、GerD-GFP蛍光胞子の2つの病巣が異なるスタックに現れ、3つの総GerD-GFP病巣がコプラスZ3スタックで観察された。
ここでは、胞状D-GFP焦点が胞毛内に1つだけある胞状の胞状が観察された。合計で、胞子の約40〜50%がそれぞれ2つまたは1つのGerD-GFPおよびGerKB-mCherryクラスターを有していた。GerD-GFP足場タンパク質の積分強度は異なる集団間で異なっていましたが、GerKB-mCherryの積分強度は異なる集団で同じでした。
胞子が複数の病巣を有すると、GerD-GFPおよびGerKB-mCherry病巣の最大蛍光強度は減少する傾向があり、ゲルミノソーム病巣とみなされるすべての明るいスポットの最大蛍光は、PS4150胞子の最大自発蛍光よりも高かった。特に、発芽病巣に似た明るいFM4-64スポットは、無傷および脱コーティングされたPS4150胞子の両方に現れ、これらの明るいFM4-64スポットが内膜のゲルミノソームタンパク質のクラスタリングに関与する可能性があることを示唆している。アガロースに胞子を追加し、フレームにアガロースを配置するには、これらのミニ材料のための継続的かつ慎重な流体の動きが必要です。
KGB80の生殖細胞の3D-SIM生画像を疑似広視野画像に変換し、その解釈には胞毛生物学に関する専門知識が必要です。当社の構造化照明顕微鏡法は、異なる細菌や他のバンド材料における低い豊富なタンパク質または薄暗い蛍光レポーターのイメージングに適用することができます。発芽体の組織は、バチルス発芽タンパク質および特異的膜ドメインの共局在化を評価するために二重標識手順を用いて研究することが可能になりました。
