评估目标参与度，即药物与它所设计的蛋白质的相互作用，是解释药物开发或基础研究项目中任何化合物的生物活性的基本要求。该技术的主要优点是，它允许直接测量KDM1A目标接触的剂量效应和动力学，而不是测量下游效应，如组蛋白标记和表达。该技术可应用于基础研究和临床试验，在肿瘤学中 CNS 或其他受 KDM1A 抑制剂治疗的疾病中，用于研究药理学。
该技术基于一种化疗开发，用于研究 ORY-1001，iadademstat，但可以真正用于其他KDM1A抑制剂，该策略可应用于其他靶点。该程序将由我实验室的PK/PD发现平台的操作经理Raquel Ruiz演示。在用 ORY-1001 进行细胞治疗期间，化合物与细胞核中的 KDM1A 蛋白结合。
为了开始此过程，从冰箱中取出 10 微升一次使用 20 毫摩尔生物基化探针 OG-881 库存溶液，让它在室温下预热 10 分钟。使用带滤芯的微管，连续稀释库存溶液，以准备两个微摩尔工作溶液。接下来，在微离心管中溶解一片蛋白酶抑制剂在一毫升PBS中。
对于每毫升所需的1x细胞解液缓冲液与化疗，混合100微升商业获得的10x细胞解液缓冲液，150微升的10x蛋白酶抑制剂，12.5微升的两微摩尔OG-881工作溶液和737.5微升1型双蒸馏水。细胞在1x解液缓冲液中，在与任何自由KDM1A蛋白结合的化疗存在的情况下。要从组织中准备，请使用在干冰上冷藏的砂浆和害虫来粉碎一立方厘米的冷冻组织并均质化。
将组织分成一次使用小瓶，确保将大约40毫克的组织粉末转移到每个小瓶中，同时避免在所有的时间解冻。将样品存放在 80 摄氏度，直到准备好处理。为了从细胞颗粒中准备，在含有25纳米摩尔OG-881的1x细胞解液缓冲液的200微升中重新填充约1000万个细胞的颗粒。
每个样品都短暂旋转，并把它们放在冰上五分钟。使用声波器，以 45 千赫的三个脉冲对样品进行声波化，每次持续 20 秒。将样品在冰上放置20秒的脉冲之间。
将样品放在冰上再加五分钟。然后，在4摄氏度的离心机中短暂旋转，将样品以14000倍G离心10分钟。使用一毫升微管将每个上一液转移到单独的 1.5 毫升微离心管中。
加工前将管子放在冰上两个小时。然后，使用文本协议中概述的布拉德福德测定来量化原生蛋白质。总板涂有抗KDM1A抗体。
自由板涂有链球菌素。然后将细胞酸盐添加到两个板中，直接或通过化疗捕获 KDM1A 复合物。用抗KDM1A检测抗体和与马萝卜过氧化物酶耦合的二级抗体清洗和孵育板。
最后，添加发光基板并生成信号。对于总 KDM1A ELISA，在PBS中准备10毫升KDM1A捕获抗体，最终浓度为每毫升2微克。将 100 微升转移到板的每个井中。
对于免费的KDM1A ELISA，在PBS中准备10毫升的链球菌素，每盘浓度为每毫升10微克。将 100 微升转移到板的每个井中。然后，顶部用胶粘膜密封每个板，并在摄氏四度下孵育过夜。
第二天，从冰箱中取出盘子，让它们在室温下平衡约45分钟。用洗涤缓冲液清洗每个盘子三次，确保每次洗涤步骤后敲击纸巾上的盘子，以去除任何残留溶液。在两个板的每个孔中添加 200 微升的阻塞缓冲液。
顶部用胶膜密封板，并在室温下孵育两小时。同时，用PBS稀释先前获得的原生蛋白质提取物，以适当的浓度，并布置板，以准备一个标准曲线使用人类rKDM1A，如文本协议中概述。两小时后孵育完成，丢弃堵塞缓冲液，用洗涤缓冲液清洗板，确保每次洗涤步骤后敲击纸巾上的板，以去除任何残留溶液。
在文本协议表2中的板材分布后，将适当的稀释样品转移到冷藏的96深井储存块中。保持这个块在冰上，同时将每井100微升移入总和自由的ELISA板，按照文本协议表三中的板分布。在室温下孵育一小时，然后丢弃样品，用洗涤缓冲液清洗盘子五次。
以每毫升0.125微克的浓度在阻断缓冲液中准备20毫升兔子抗KDM1A检测抗体。在两个板的每个孔中加入100微升的检测抗体溶液，除了与阴性对照相对应的孔。顶部用胶膜密封板，并在室温下孵育一小时。
在此之后，丢弃检测抗体溶液，用洗涤缓冲液清洗板六次。准备25毫升的二次山羊抗兔抗体HRP，以稀释1至5000的阻尼缓冲液。在微刺激板的每个孔中加入100微升的二次抗体溶液，并在室温下孵育一小时。
在此孵化结束前 30 分钟，在柔和的光线条件下，将发光醇增强剂和过氧化物溶液的等件混合在琥珀色瓶中。将混合物留在室温下。当一小时的孵育完成时，丢弃二次抗体溶液，用洗涤缓冲液洗盘子六次。
接下来，将100微升的发光灯工作溶液移至板材的每个孔中，确保移液速度非常慢，避免气泡形成。使用定时器控制添加溶液和板的发光测量之间的时间，并保持此时间恒定，以实现良好的间分析可重复性。顶部用胶粘膜密封板，离心机在 500 倍 G 和室温下 45 秒，以消除任何剩余的气泡。
以 100 rpm 的速度将板摇床上的板孵育一分钟。然后，取出胶粘膜，将板插入微孔板读卡器中，并留3分钟，将温度稳定在25摄氏度。读取每个 ELISA 板测定的相对发光单位。
从原始数据电子表格文件中保存并复制原始 RLU 值，以进行进一步分析。在这项研究中，一种基于ELISA的新型KDM1A化疗捕获用于直接测量KDM1A靶点在细胞和组织样本中的参与度。评估总和自由 rKDM1A 的 RLU 值以验证线性度。
然后，从三个独立志愿者检测到的人类 PBMC 中检测到的总量和免费 KDM1A 的 RLU 值将叠加在标准曲线上。AML细胞按照提供者的建议进行培养，并处理不同浓度的车辆或 ORY-1001。原生蛋白质提取物在存在25毫摩尔OG-881化疗和0.5微克总蛋白用于执行目标参与分析的情况下获得。
然后确定总计和免费 KDM1A，并计算 ORY-1001 与 KDM1A 的目标参与率相对于车辆。剂量响应KDM1A目标参与PBMC和肺部治疗大鼠与 ORY-1001口服加瓦奇，计算相对车辆组显示在这里。用25纳米摩尔OY-1001从车辆处理过的动物中提取的肺蛋白提取物进行外活孵育，产生全TE，但并没有进一步增加被治疗的大鼠的TE，每公斤 ORY-1001的30微克，证实KDM1A在体内已经完全抑制。
该协议通过测量免费和总 KDM1A 来评估 KDM1A 目标参与度。请记住，它需要本地蛋白质提取。这种技术可用于不同物种的样品，以评估特定的抑制剂，也可以筛选新的抑制剂。
本研究中使用的化疗也可以应用于化疗学研究KDM1A相互作用。在处理生物样品和生物活性化合物（如KDM1A抑制剂）时，请时刻记住安全工作并尊重预防措施。
