DREADD 是最流行的化学遗传学方法，用于远程控制神经元活动。在这里，我们为重复或慢性 DREADD 控制提供新的替代方案，专注于侵入性较小的 CNO 交付方法。我们描述了通过重复性眼药水或长期通过动物的饮用水在小鼠中长期传递CNO的两种策略。
此处描述的协议是 CNO 交付的慢性和非侵入性选项的示例，这些选项可以适应各种实验设计，包括不同的 DREADD 变体、组织，甚至物种。CNO 分娩的一个关键问题是动物的压力和疼痛。这些协议最大限度地减少了此问题，并且易于执行和适应不同的实验设置。
在进行手术之前，清洁和消毒立体气框架和所有所需的仪器。当框架准备就绪时，确认在麻醉混合背景野生雄性小鼠中对头趾捏没有反应，剃光头部，将鼠标头固定到框架上。然后在眼睛上涂抹眼部保护润滑剂，最后用连续的波维酮碘和70%乙醇磨砂清洁裸露的皮肤。
使用无菌手术刀露出头骨，并校准框架到带毛点。在介质侧坐标为 2.9 毫米，在负 2.7 毫米的前部坐标处钻孔，以瞄准海马。当大脑暴露时，使用微喷油器和拉微胶囊移液器，在零三毫米的背腹深度下，单方面将90纳米的腺连接病毒注射到海马体中。
然后用尼龙缝合线关闭切口，将动物从框架中取出，进行镇痛治疗。对于重复的CNO分娩，从注射后四周开始，在滴注前三到四天，每天将每只老鼠擦伤三分钟，使动物适应处理。当小鼠已适应处理时，称量每只小鼠，以确定要交付的适当量的CNO，以达到每公斤体重浓度1毫克的CNO。
在非活动阶段熄灯前两小时，将准备好的 CNO 溶液的一到三微升加载到 P10 微移子中，然后通过擦伤固定鼠标。缓慢排出溶液，直到移液器尖端形成稳定的液滴，并小心地将液滴靠近角膜，直到溶液在不接触移液器尖端的情况下送到小鼠的眼睛。然后将鼠标返回到其家庭笼子，然后再将 CNO 眼药水涂到下一个动物的眼睛。
在小鼠活动阶段需要提供 CNO 的情况下，请确保存在暗红色光，以正确处理动物和进行 CNO 交付。对于慢性CNO治疗，从注射后四周开始，在开始治疗前三天，用用橡胶喷口停止的小瓶子替换普通水瓶，用含有10毫升普通水的铝箔覆盖。用胶带固定到笼子上，让老鼠适应瓶子。
测量每只鼠标的每日用水量，并称量每只鼠标。测试一系列 CNO 浓度，以确定以最小 CNO 浓度显示最大有效性的剂量。然后在每个小瓶子中装满8毫升的常规水，外加所需的CNO量。
对于受限的CNO治疗，从注射后四周开始，在开始治疗前三天，在动物活动阶段的最后一部分，将装有10毫升水的小瓶子加1%蔗糖放在笼子里，远离原水瓶。在接触结束时，从每个笼子中去除水加蔗糖溶液，并测量每种动物的蔗糖用水量。对于 CNO 的递送，请向瓶子中装满五毫升水，外加 1%蔗糖和每公斤 CNO 1 毫克。
将瓶子放在与在活性相的最后一段糖水适应期相同的位置，取出瓶子并测量所证明的耗水量、蔗糖和 CNO 量。在实验结束时，将经过治疗的动物大脑收获成新鲜的固定剂。9至12小时后，在30%蔗糖溶液中冷冻保护脑组织。
当大脑下沉时，将样品分到低温恒温器上。当获得所有大脑部分并阻断非特异性结合时，在四摄氏度下用抗 c-Fos 抗体溶液孵育组织样本，并持续搅拌。第二天早上，每次洗涤用三个五分钟的新鲜PBS清洗样品，然后用适当的荧光结合二次抗体孵育样品。
在室温下一小时后，在不受光线影响时，通过荧光共理显微镜获取标记组织部分的数字图像。将图像加载到 ImageJ 后，在测量 Adeno 相关感染 mCherry 阳性细胞区域时进行轮廓，并量化该区域内的 C 假阳性细胞数，以获得每个区域激活的细胞数。使用眼药水重复性 CNO 传递在大多数受感染的神经元中引起 cFos 表达的强健诱导，表明 CNO 传递的有效性在重复暴露期间是持续的。
此外，与在 CNO 暴露后 6 小时获得的样本相比，在 CNO 治疗后两小时采集的样本中观察到大量 cFos 诱导，这表明 CNO 引起的变化取决于时间。与正常用水量相比，每天的用水量加CNO没有显著差异。同样，夜间消耗的蔗糖量不受CNO添加的影响，在五天的实验期内，水加CNO的每日消费量和蔗糖加CNO的日消费量也不同。
与 CNO 眼药水的应用类似，在两次（但不是 6 小时的 CNO 饮用水访问）后，观察到 cFos 的强健诱导。此外，与盐水控制相比，低 CNO 剂量不会引起 cFos 激活，而高剂量则可引出稳健且相似的 cFos 诱导，因此 CNO 的有效性阈值非常明确。我们建议执行剂量反应分析，以定义不会显著减少神经元活化的最低CNO剂量，并考虑使用氯扎平作为配体。
在这里，我们演示了使用CNO中导的cFos诱导作为神经元激活的结果。然而，这些协议可以很容易地被采用到电生理分析或行为测试。DREADD 技术是远程控制神经元活动以及设计 CNO 传递替代策略的有力工具。
我们将增加实验设置和潜在临床干预的多种选择。
