我们的无细胞蛋白质表达协议利用来自快速生长的Vibrio natriegens细菌的高活性粗提取物，该细菌使用简单且具有时效率的两步声波离心过程进行。单用户可以在一到两天内实现粗细胞提取物制备和无细胞蛋白质合成，使该技术能够轻松集成到用于生物生产或合成生物学应用的管道中。开始洗一毫升的隔夜Vibrio natriegens培养，在台式离心机中离心，以10，600倍g的一分钟。
在不干扰颗粒的情况下吸制上一液，并在一毫升新鲜 LB-V2 介质中重新暂停。在自动洗的四升困惑的 Erlenmeyer 烧瓶中，将一毫升洗过夜培养基接种到一升新鲜 LB-V2 生长介质中，并配有无菌盖，实现一至一千稀释配给。在 30 摄氏度下生长培养，同时摇动至 225 RPM。
使用分光光度计监测培养物 OD 600。当它达到1.0加或负0.2收获培养，通过离心在两个500毫升管在3，500倍g20分钟在4摄氏度，然后放在冰上。吸上一液并立即处理颗粒。
在开始细胞解解程序之前，冷却新鲜准备的 S30 解液缓冲液 pH 7.7 至大约 4 摄氏度，使用 10 毫升的这种冷 S30 解液缓冲液重新悬浮来自同一一升培养的所有颗粒。将悬浮液转移到50毫升的管子上。在4摄氏度下以3，500次g离心，10分钟，然后在不干扰颗粒的情况下吸进上一代，并放在冰上。
在冷室工作，在放在冰上的50毫升管中，向颗粒中加入500微升的冷S30解液缓冲液。使用宽孔移液器尖端重新暂停颗粒，并小心地将其转移到冰上的两毫升管中。为了产生非常活跃的原油提取物，我们必须确保细胞没有过度稀释S30缓冲液，但有足够的液体进行有效的声波化。
将 600 毫升烧杯装满冰，并在冰上放置一个两毫升管架。短暂地旋转管子，使细胞均质化。轻拂以取出盖底部的任何细胞，并放入打开盖的管架中。
降低声波尖端进入管中的细胞悬浮液，使它只是在液体表面之下。使用声波器和直径为 1/8 英寸的探头准备声波设置。将声波器设置为 20 千赫频率和 50% 振幅。
脉冲打开时间 10 秒，脉冲关闭时间 60 秒。运行脉冲声波协议三个周期。然后在4摄氏度下以16，000倍g的离心离离，提取30至45分钟，直到酸盐没有任何细胞碎片。
在声波发生时目视检查细胞解解对于确保声波化如预期的那样工作至关重要。在冷室工作，将产生的超级钠的50微升液分到新的两毫升管中，确保不干扰颗粒。要闪冻这些粗细胞提取物，将管子放入管架中，并连接一根浸渍根，并浸入含有液氮的脱氮液中，并检查是否冷冻。
使用DNA模板解冻10X能量溶液主混合、4X氨基酸主混合等分、室温下DNA模板进行无细胞蛋白表达。然后从零下20摄氏度的冰柜中取出T7RNA聚合酶和RNAse抑制剂，放在冰上。一旦DNA模板，10倍能量溶液主混合，和4X氨基酸主混合解冻，放在冰上。
通过将每个成分按精确顺序添加到冰上两毫升管中，并准备无细胞反应主混合物，并在每次添加到主混合物后轻轻轻拂管。从零下80摄氏度的冰柜中取出维布里奥纳特里根的粗细胞赖化，放在冰上10至20分钟，直到解冻。将适当体积的解冻粗细胞提取物添加到无细胞反应主混合物中，并使用移液器轻轻混合。
要使用热循环器执行端点无细胞蛋白表达，首先在 96 井 PCR 板底部的每个井中添加 10 微升无细胞反应主混合物，确保通过在每次转移到 PCR 板之间轻轻轻拂管来混合主混合物。将板以1000倍g离心10秒，以将可能粘在井两侧的任何主混合物集中。然后用板粘合剂密封油井，防止蒸发。
将板放入温度为 26 摄氏度的热循环器中，加热盖设置为 105 摄氏度。在PCR板中孵育反应至少三个小时后，表达的蛋白质可以进行纯化、量化，并用于下游过程。使用无细胞反应主混合到黑色 384 井测定板底部的透明玻璃底的板读卡器移液器 10 微升来监测无细胞蛋白质表达动力学。
用透明板胶粘剂密封油井，防止蒸发。将检测板放入26摄氏度的板读卡器中，孵育3至6小时，同时监测与表达的蛋白质对应的适当荧光激发/发射波长。该协议中描述的无细胞表达系统通过质粒DNA模板产生比端点和动力学测定显示的相同数量的线性DNA的蛋白质量达到最佳效果。
体外转录反应产生的mRNA也可用于使用，但需要更高数量的mRNA。镁和钾离子的浓度对蛋白质生产的产量有显著影响。在优化条件下，最佳镁离子浓度为3.5毫摩尔，钾离子为80毫摩尔。
因此，偏离这些最佳离子浓度可能导致该表达系统产生大量蛋白质的容量下降。重要的是要保持所有的试剂在冰上或工作在冷室尽可能多。此外，适当和完整的声波化对于该协议的成功至关重要。
按照该协议，用户将有能力以高通量格式表达蛋白质，可用于纯化和筛选许多不同的蛋白质的活动。这项技术演示了使用具有独特特性的新生物体进行无细胞表达。Vibrio natriegens 是一种嗜血性快速生长的细菌，可能为蛋白质或小分子的表达提供独特的条件，这些蛋白质或小分子以前在已建立的模型生物体中尚未开发。
