使用斑马鱼细胞系的细胞毒性测定方案可以回答有关化学物质对鱼类的急性毒性的问题，或帮助确定其他替代鱼类测定的适当测试浓度。这种96孔板测定的主要优点是结合不同的活力终点来确定斑马鱼细胞的细胞毒性，斑马鱼细胞是生态毒性研究中的重要鱼类。协议非常简单。
如果您正确执行所有描述的步骤，则应该不会遇到任何问题。该协议有助于实现无动物生态毒性研究，评估来自不同器官或生命阶段（如胚胎细胞中的肝细胞）的鱼细胞系的影响。要开始接种ZEM2S或ZFL细胞，请计算获得所需数量的细胞进行测定所需的相应细胞悬液的体积。
用相应细胞系的完整培养基填充无菌试剂储液器，并将计算的细胞悬液体积转移到储液器中，总体积为20毫升。使用多通道移液器，轻轻上下混合溶液，不要形成任何泡沫或气泡。然后使用多通道微量移液器，向透明聚苯乙烯96孔板的每个孔中加入200微升细胞悬液，以获得ZEM2S细胞每孔60， 000个细胞的活细胞计数和ZFL细胞每孔40， 000个细胞的活细胞计数。
将板在 28 摄氏度下孵育 24 小时。要将任一类型的细胞暴露于不同浓度的测试化学品中，请在培养基中为目标细胞系制备所需浓度的测试化学溶液，而无需胎牛血清或FBS。孵育24小时后，使用多通道微量移液器小心地将用过的培养基从孔中丢弃。
然后每孔加入100微升特定的测试化学溶液，一式三份，这意味着每个测试化学浓度有三个孔。将对照组与测试化学品在同一板上，一式三份。对于空白对照，在三个无细胞孔中加入100微升暴露培养基。
对于阴性对照，将100微升暴露培养基加入三个含有细胞的孔中。对于阳性对照，将三个含有细胞的孔暴露于暴露培养基中制备的1%Triton X-100溶液中。用封口膜或粘合剂密封箔密封板以防止培养基蒸发，并将板在 28 摄氏度下孵育 24 小时。
在测试化学品暴露24小时后，通过将内容物倒入收集盘中，小心地将暴露介质从孔中丢弃，并用200微升PBS洗涤每个孔。然后，为了在不丢失细胞的情况下取出PBS，请小心地将其倒入收集托盘中。为了进行Alamar Blue或AB和CFDA-AM测定，每孔加入100微升相应的溶液，并在28摄氏度的黑暗中孵育板30分钟。
接下来，在文中提到的合适的激发和发射波长下测量荧光读数器中的荧光。为了进行中性红色或NR测定，取浓度为每毫升40微克的NR工作溶液，并以600G离心10分钟。接下来，通过将内容物倒入收集盘中，小心地从孔中取出先前添加的AB和CFDA-AM溶液。
使用多通道微量移液器，每孔加入100微升NR工作溶液，并将板在28摄氏度下孵育3小时。孵育结束后，小心地将板中的NR溶液倒入收集盘中，并通过每孔添加150微升PBS来洗涤孔。洗涤后，每孔加入150微升NR提取溶液，并通过在平板振荡器上轻轻摇动板10分钟来孵育板，然后使用读板器测量540纳米处的吸光度。
为了进行MTT测定，在24小时测试化学品暴露后，通过将内容物倒入收集盘并使用多通道微量移液器小心地除去暴露介质，在黑暗中每孔加入100微升MTT工作溶液。将板在28摄氏度下在黑暗中孵育四个小时。然后通过将内容物倒入收集盘中来丢弃MTT溶液，并向每个孔中加入100微升DMSO以提取甲臜晶体。
将板在摇板器上孵育10分钟，然后使用读板器测量517纳米的吸收。对于AP测定，对应于空白，阳性对照和高细胞毒性浓度的测试化学物质的孔显示蓝色和低荧光，表明活细胞的缺失或减少。相反，对应于低细胞毒性浓度的测试化学和含有大量活细胞的阴性对照的孔将刃天青转化为具有较高荧光的粉红色试卤灵。
对于NR测定，测试化学物质和阳性对照的高细胞毒性浓度为透明或淡粉红色，吸光度低，而含有保留NR染料的活细胞的孔显示深粉红色和高吸光度。同样，对于MTT测定，没有活细胞的孔是透明的，而含有活细胞的孔将MTT转化为紫色的甲马赞。根据计算的细胞活力百分比，估计ZFL和ZEM2S细胞系中不同测试化学物质的一半最大抑制剂浓度或IC50值。
在有和没有FBS的培养物中，细胞活力没有显着差异，表明去除FBS的培养基在24小时的化学暴露期内的适用性。MTT和NR测定显示，从0.1%到1%的变化DMSO浓度对细胞活力没有显着影响，表明这些细胞系支持使用DMSO作为溶剂高达1%在处理电镀细胞时特别注意避免在整个过程中自脱落，并仔细准备中性红色工作溶液以避免任何染料沉淀。该程序可应用于使用体外模型解决化学对鱼类影响的几个方面的研究，并有助于无动物生态毒性研究的进展。
