通过双路西法酶检测系统构建CRISPR质粒和检测哺乳动物细胞的挖空效率

该协议描述了生成和优化高效 sgRNA 载体的关键步骤。我们对候选 sgRNA 的预加速针对相对时间和推论。该协议的主要优点是，它使得分析每个sgRNA的DNA编码印象，而无需编辑内源基因。

这种预选择方法也可以通过双链断裂应用于其他基因编辑措施。首先将冻干寡核苷酸稀释到双蒸馏水中的最终浓度为10微摩尔。在薄壁PCR管中以一比一的比例混合前进和反向寡核苷酸，无需添加任何额外的缓冲液。

在95摄氏度下孵育混合物5分钟，然后将温度降到72摄氏度10分钟。从 PCR 机器上去除寡核苷酸混合物，并允许它在室温下冷却。要消化pX330-xCas9载体，与Bbs1一起，将载体、酶和消化缓冲液在50微升体积中结合，并在37摄氏度下孵育反应两小时。

进行细胞转化后，从 LB 板中选择 5 到 10 个细菌菌落，并在 1.5 毫升管中使用 1 毫升 LB 培养基接种 1 毫升 LB 介质。然后在旋转摇床上孵育管子两到三个小时。执行 PCR 以筛选文本手稿中描述的重组质粒，然后在每厘米 10 伏以下的 2% Agarose 凝胶上运行产品。

识别阳性质粒后，使用它们以及记者向量共同感染适当的细胞系。要对细胞进行精使，请从培养的细胞中去除生长介质。用 PBS 轻轻清洗培养容器的表面，将 100 微升 PLB 放入每个培养井中，以完全覆盖细胞单层。

让板在室温下孵育20分钟，然后将落酸转移到管或小瓶中，以进行进一步处理或储存。要执行双荧光素酶测定，对亮度计进行编程，以提供两秒的预读延迟，然后进行 10 秒的测量周期。然后，将100微升荧光素测定试剂分配到适当数量的发光计管中。

小心地将20微升的细胞利沙酸盐加入发光计管中，通过移液混合两到三次。将管子放在发光计中并启动读数。从发光仪上拆下样品管。

加入100微升停止试剂和涡流短暂混合。将样品返回亮度计并开始读数。记录蕾妮拉路西法酶活动，与萤火虫路西法酶活动正常化，特别是屏幕上显示的比例的倒数。

完成后丢弃反应管。该方法用于为绵羊DKK2 Exon 1生成三个sgRNA载体。sgRNA 和 xCas9 表达载体是通过预先消化向量骨干，然后通过退火寡对将载体骨干连接成一系列短的双链 DNA 片段而构建的。

用特定的底基因对引导PCR对筛选了7个细菌菌落，并检测出阳性菌落。通过双荧光素酶测定同时检测出pX330-xCas9 T1、T2和T3的基因靶向能力。最后一个sgRNA载体显示最高的检测信号，随后用于绵羊基因编辑研究。

按照此协议，可以进行 T7EI 测定或核糖核酸酶测定。这些额外的措施给内源基因编辑更准确的印象。