在这里，我们提出制备含有横向原生核的急性脑片和视网膜原生基因突触功能的电生理学研究的协议。视网膜结节细胞轴子进入远离皮质输入的横向基因原子核。这允许单独刺激视网膜原生和皮质基因突触，它们具有非常不同的功能属性。
要开始此过程，请准备两个切片室，一个填充 100 毫升解剖溶液，另一个填充 100 毫升的记录溶液。将两个烧杯放入37摄氏度的水浴中，并在解剖前至少15分钟用碳化物泡溶液。接下来，在塑料烧杯中填充250毫升近冰冷解剖溶液，并在使用前至少用碳原泡15分钟。
然后用冷解剖溶液填充塑料培养皿，用于大脑解剖。将一张纸放在培养皿的盖子中，并加注少量解剖溶液。随后冷却振动器的解剖室。
将头部的皮肤从头骨切到鼻腔，并用手指保持头部打开，露出头骨。要获得前脑，首先沿着后/前中线切割头骨。然后通过冠状缝合和羊皮缝合再切两次。
取出牙冠缝合线和羊皮缝合线之间的头骨，露出大脑。切开嗅觉球，用细刀片将前脑与中脑分开。用一根细铲子将大脑从头骨上取出，并放在培养皿盖上的滤纸上。
为了保持大脑切片中后向阳核的感官和皮质输入的完整性，以三到五度的角度将两个半球分离。之后，将两个半球的中面横向平面放在滤纸上，将其干燥。然后将它们粘在切割舞台上，角度从水平平面 10 到 25 度。
将舞台放在金属缓冲盘的中心，轻轻将其余的冰冷的解剖溶液倒入缓冲盘中。小心执行此步骤，因为浇注太硬可能会去除粘贴的大脑。接下来，将缓冲盘放在装满冰的托盘中，以保持解剖期间的低温。
第 250 微米切片，以 0.1 毫米/秒的速度和 1 毫米的振幅使用剃刀刀片。将切片转移到充满含氧解剖溶液的保持室，在34摄氏度下约30分钟，然后让切片在34摄氏度的录音溶液中恢复30分钟。恢复后，从水浴中取出切片室，将切片保持室温，直到实验使用。
在此过程中，使用硅酸盐玻璃毛细管和灯丝拉拔器拉动记录移液器。接下来，使用相同的协议拉刺激移液器，但拉后稍微断开尖端以增加直径。随后用细胞内溶液和生物细胞素填充记录移液器，用记录溶液填充刺激移液器。
然后将切片放在记录室中，并在室温下连续用含氧记录溶液进行吸气。使用配备 IR-DIC 视频显微镜的直立显微镜可视化切片。检查所有切片，并选择显示完整光学区域的切片。
在用记录移液器修补细胞之前，将刺激移液器放在切片上。要研究视网膜原生突触，请将刺激的移液器直接放在来自视网膜结节细胞的轴突纤维捆绑的光学区域上。要分析皮质原基因突触，请将刺激电极放在核上，核核与后向性基因核相邻。
一旦记录移液器浸入记录溶液中，应用五毫伏步骤来监控移液器电阻。将保持电位设置为零毫伏，并取消偏移电位，使保持电流为零皮安培。在施加正压时，用记录移液器接近细胞。
当移液器与细胞膜直接接触时，释放正压，将保持电位设置为负 70 毫伏。然后施加轻微的负压，使细胞膜附着在玻璃移液器上，使千兆孔密封形成。补偿移液器电容，并应用负压脉冲打开电池。
要研究突触功能，请通过刺激移液器应用0.1毫秒电流脉冲。通过应用五毫伏步长连续监控系列电阻。通过将五毫伏乘以所唤起电流的峰值振幅来估计系列电阻。
仅使用序列电阻小于 20 兆欧姆的细胞进行分析。对于生物细胞标记，保持全细胞配置至少五分钟，以允许生物细胞素扩散到致心树突。录音后，轻轻地从细胞中取下移液器，使索玛不会被破坏。
准备一个24井细胞培养板。每井填充 300 微升 4%PFA。注意不要污染任何与要记录的切片接触的 PFA。
用橡胶移液器将切片从录音室转移到含 PFA 的板，并在夜间进行固定。第二天，用 PBS 替换 PFA。将 PBS 中的切片保持 4 摄氏度，以进行未来处理。
要弄脏细胞，用新鲜的PBS洗切片三次。在轨道摇床的室温下在室温下将切片孵育两小时，阻断非特异性结合位点。然后丢弃阻塞溶液，在轨道摇床上以四摄氏度的温度下孵化在阻塞溶液中稀释的链球菌亚历克萨568。
第二天，丢弃抗体溶液，用PBS清洗切片三次，在室温下在轨道摇床上清洗10分钟。然后在安装前用自来水清洗切片。将一只鼠标的切片放在一个玻璃幻灯片上。
确保染色的细胞存在于切片的上表面。用纸巾吸收切片周围的水，然后让切片干燥约15分钟。随后，在每个切片上涂抹两滴安装介质，并在不产生气泡的情况下在滑轨上安装盖滑。
使用共体显微镜观察标记的切片后，将切片存放在摄氏四度。此 IR-DIC 图像显示了具有贴片移液器尖端的后向性基因核中继神经元的 soma。生物细胞染色使我们能够获得记录神经元的视图。
与具有双相形态的内维龙不同，中继神经元具有多极性树突状，含有三个多主树突。然后生成生物细胞素标记的中继神经元的三维重建，该神经显示了径向对称树突结构。保留视网膜原生输入和同一脑片中的皮质基因输入是本协议中最重要的。
遵循这个程序，例如，我们还可以研究从核的抑制剂输入到后向横向基因核神经元。在用 PFA 固定脑片时，记得戴手套，因为 PFA 是危险的。
