该协议是重要的，因为它允许在同一脑区域的两个蛋白质的定量。这使得实验者能够通过检测泛蛋白和磷蛋白来研究大脑区域分子信号通路的活动。它也可以用来检测蛋白质，这是不同认知现象的标记。
我们使用一种相对简单的技术，如免疫组织化学，来回答通常需要更多参与技术的问题。包括检查分子信号通路的活动，检查AMPA/NMDA比率。使用低温恒温保持在零下9摄氏度和零下12摄氏度之间，切片以前分离和冷冻的老鼠大脑在感兴趣的区域在30-50微米。
直接将切片安装到玻璃幻灯片上，并在零下 80 摄氏度下储存，直到免疫细胞化学。从冰柜中取出玻璃滑梯，让其平衡到室温 30 分钟。在烟罩下工作，将幻灯片放在 0.1 摩尔 PBS 中的 4% 半甲醛中，在室温下放置一到两个小时，用于组织固定。
然后用 0.1 摩尔 TBS 冲洗幻灯片三次，每次 10 分钟。要渗透细胞膜，在温和的洗涤剂中孵育幻灯片30-60分钟。在 TBS 中再次冲洗三次，每次冲洗 15 分钟。
稀释PBS中感兴趣的蛋白质的原抗体，浓度正确，如手稿所述。移液原抗体溶液直接到脑组织上。将盖板滑在幻灯片上，在室温下在原抗体稀释中孵育脑组织1-2小时。
孵育后，取出盖板，在TBS中清洗含有少量洗涤剂的幻灯片，每次四次，每次15分钟。在含有TBS、洗涤剂和1.5%宿主血清的稀释剂中稀释二次抗体。在幻灯片中加入二次抗体，盖上盖板，在室温下孵育两小时。
孵育后，用TBS-T冲洗幻灯片四次，每次20分钟，然后用TBS冲洗四次，每次冲洗20分钟。在黑暗中，在夜间在室温下干燥滑梯。将幻灯片放置到近红外扫描接口上，组织朝下。
使用选择工具一次成像多个幻灯片。使用分辨率为 21 微米的最高质量设置对幻灯片进行图像图像。在零纳米偏移中，将图像导入图像分析软件，用于半量化蛋白质分析的查看和标记。
打开图像分析软件后，选择扫描图像的工作区。然后在图像分析软件中打开扫描图像，查看扫描并调整显示的波长、对比度、亮度和放大倍率，而不更改原始图像或总量化发射。确定要量化的关键区域后，沿页面顶部选择分析选项卡，然后选择绘制矩形以在要量化的区域上绘制矩形。
要查看矩形大小，请选择屏幕左下角的形状。然后沿右下角选择列。然后添加高度和宽度列以标识形状大小。
最后，命名形状并重复。采样所有区域后，继续合并和分析列选项卡中可用的数据。为了验证此协议是否有效，大脑部分被孵育为初级抗体和二级抗体，单独使用二级抗体，或既不是初级抗体，也不是二级抗体。
只有在对脑组织应用初级抗体和二级抗体时，才能在后海马和杏仁核中检测到直接的早期基因c-jun表达。在杏仁核的粪便蛋白检测中，测定了AMA受体的GluR1亚单元和NMDA受体的NR2A亚单元。这允许检查AMBA NMDA受体在杏仁核亚核的比例，这是学习和记忆的神经生物学特征。
蛋白质表达的均值和规范化测量值来自心海马体的高分辨率扫描。使用图像分析软件，在感兴趣的区域放置一个矩形，并且使用形状中平均光强作为荧光表达的度量，这是蛋白质表达的度量。为了获得规范化曲线，在曲线下区域表示高信号和低信号的区域放置了形状，作为蛋白质表达的度量。
与这个程序最大的困难是找到一个抗体，并确保它的工作原理。应用程序很简单。我的建议是先尝试一个常规的免疫石化学程序，然后尝试这种技术。
始终先执行验证检测。要记住的最重要的事情是检查你的抗体稀释，并确保它正确应用。如果没有这些步骤，该过程将失败。
