このプロトコルは、同じ脳領域内の2つのタンパク質の定量化を可能にするので、重要である。これにより、実験者は、パンおよびリンフォタンパク質をアッサングすることによって、脳領域における分子シグナル伝達経路の活性を調べることができる。また、異なる認知現象のマーカーであるタンパク質のアッセイにも使用できます。
免疫検査などの比較的単純な手法を用いて、一般的により関与する技術を必要とする質問に答えています。分子シグナル伝達経路の活性を調べることを含む,AMPA/NMDA比を調べる。マイナス9度とマイナス12度の間に維持されたクライオスタットを使用して、30〜50マイクロメートルの関心領域で以前に単離され、凍結したラット脳をスライスする。
ガラススライドに直接スライスを取り付け、免疫細胞化学までマイナス80度で保存します。冷凍庫からガラススライドを取り出し、室温まで30分間平衡させます。ヒュームフードの下で作業し、組織固定のために室温で1〜2時間0.1モルPBSで4%パラホルムアルデヒドにスライドを置きます。
その後、0.1モルTBSでスライドを3回3回10分間すすます。細胞膜を透過させるには、中性洗剤でスライドを30〜60分間インキュベートする。そして、TBSで再び15分間3回すすいでください。
原稿に記載されているように正しい濃度でPBSに関心のあるタンパク質に対する一次抗体を希釈する。ピペット一次抗体溶液を脳組織に直接。スライドにカバースリップを置き、一次抗体希釈液中の脳組織を室温で1〜2時間インキュベートします。
インキュベーション後、カバースリップを取り外し、少量の洗剤を加えたTBSでスライドを洗浄し、それぞれ15分間4回洗浄します。TBS、洗剤、および1.5%の宿主血清を含む希釈二次抗体。二次抗体をスライドに加え、カバースリップで覆い、室温で2時間インキュベートします。
インキュベーション後、TBS-Tのスライドをそれぞれ20分間4回、TBSでそれぞれ20分間4回リンスします。暗闇の中で室温でスライドを乾燥させ、一晩乾燥させます。スライドを近赤外線スキャンインターフェースに配置し、組織を下に向けます。
選択ツールを使用して、複数のスライドを一度にイメージ化します。解像度 21 マイクロメートルの最高品質設定を使用して、スライドをイメージします。ゼロナノメートルのオフセットで、画像分析ソフトウェアに画像をインポートして、半定量的タンパク質分析の表示とマークを付けます。
画像解析ソフトウェアを開いた後、画像をスキャンした作業領域を選択します。次に、スキャンした画像を画像解析ソフトウェアで開き、スキャンを表示し、生画像または総定量化された放出を変更することなく、表示される波長、コントラスト、明るさ、および拡大率を調整します。定量の主要領域を特定したら、ページの上部にある解析タブを選択し、四角形を描画を選択して、定量化される領域に長方形を描画します。
四角形のサイズを表示するには、画面の左下にある図形を選択します。次に、右下に沿って列を選択します。次に、高さと幅の列を追加して、図形のサイズを識別します。
最後に、図形に名前を付けて繰り返します。すべての領域をサンプリングしたら、[列] タブで使用できるデータの結合と分析を続行します。このプロトコルが機能することを確認するために、脳切片を一次および二次抗体、二次抗体のみ、または一次抗体または二次抗体と共にインキュベートした。
直ちに初期の遺伝子c-jun発現は、一次抗体と二次抗体の両方が脳組織に適用された場合にのみ、眼下海馬と扁桃体で検出された。NMDA受容体のAMPA受容体およびNR2AサブユニットのGluR1サブユニットは扁桃体核における便タンパク質検出においてアッセイした。これは、学習と記憶の神経生物学的シグネチャである扁桃体のサブ核におけるAMPA NMDA受容体の比率を調べることを可能にした。
タンパク質発現の平均および正規化された尺度は、腹側海馬の高分解能スキャンから得られた。画像解析ソフトを用いて、形状からの光の対象領域と平均強度に矩形を配置し、タンパク質発現の尺度であるフルオロフォア発現の尺度として用いた。正規化曲線を得るために、曲線下の領域に高いシグナルと低い信号を発現する領域に形状を配置し、タンパク質発現の尺度として使用した。
この手順で最大の闘争は、抗体を見つけて、それが動作することを確認することです。アプリケーションは簡単です。私のアドバイスは、まず定期的な免疫学的処置を試み、次にこの技術を試してみるとよいでしょう。
常に検証アッセイを最初に実行する。覚えておくべきことは、抗体希釈を確認し、それが正しく適用されていることを確認することです。これらの手順を実行しないと、プロシージャは失敗します。
