Este protocolo é significativo porque permite a quantificação de duas proteínas na mesma região cerebral. Isso permite que o experimentador olhe para a atividade em vias de sinalização molecular em regiões cerebrais, ensaio pan e fosfoproteínas. Também pode ser usado para avaliar proteínas que são marcadores de diferentes fenômenos cognitivos.
Estamos usando uma técnica relativamente simples, como a imunohistoquímica, para responder a perguntas que normalmente requerem técnicas mais envolvidas. Incluindo examinar a atividade das vias de sinalização molecular, examinando a razão AMPA/NMDA. Usando um criostat mantido entre menos 9 graus Celsius e menos 12 graus Celsius, corte cérebro de rato anteriormente isolado e congelado em regiões de interesse a 30-50 micrômetros.
Monte diretamente fatias em lâminas de vidro e armazene a menos 80 graus Celsius até a imunocitoquímica. Retire os slides de vidro do congelador e deixe-os equilibrar a temperatura ambiente por 30 minutos. Trabalhando sob um capô de fumaça, coloque os slides em 4% de paraformaldeído em PBS molar de 0,1 por uma a duas horas em temperatura ambiente para fixação tecidual.
Em seguida, enxágue os slides em 0,1 TBS molar três vezes por 10 minutos cada. Para permeabiliar as membranas celulares, incubar as lâminas em um detergente suave por 30-60 minutos. E enxágue novamente em TBS três vezes por 15 minutos cada.
Diluir o anticorpo primário para proteína de interesse na PBS na concentração correta, conforme descrito no manuscrito. Solução de anticorpos primários pipeta diretamente no tecido cerebral. Coloque deslizamentos de cobertura nas lâminas e incubar o tecido cerebral na diluição de anticorpos primários por 1-2 horas à temperatura ambiente.
Após a incubação, remova os deslizamentos de cobertura e lave os slides em TBS que tem uma pequena quantidade de detergente adicionado a ele, quatro vezes por 15 minutos cada. Diluir o anticorpo secundário em um diluído contendo TBS, detergente e 1,5% do soro hospedeiro. Adicione anticorpos secundários aos slides, cubra com deslizamentos de cobertura e incubar à temperatura ambiente por duas horas.
Após a incubação, enxágue os slides em TBS-T quatro vezes por 20 minutos cada e, em seguida, em TBS quatro vezes por 20 minutos cada. Seque os slides à temperatura ambiente no escuro, durante a noite. Coloque slides na interface de varredura infravermelha próxima com o tecido voltado para baixo.
Imagem vários slides de cada vez usando a ferramenta de seleção. Imagem os slides usando a configuração de mais alta qualidade com uma resolução de 21 micrômetros. Em uma compensação de zero nanômetros, importe imagens em software de análise de imagem para visualizar e marcar para análise de proteínas semiquantitativas.
Após abrir o software de análise de imagens, selecione a área de trabalho em que a imagem foi digitalizada. Em seguida, abra a imagem digitalizada no software de análise de imagem para visualizar a varredura e ajustar comprimentos de onda, contraste, brilho e ampliação mostrados sem alterar a imagem bruta ou a emissão total quantificada. Depois de identificar as regiões-chave para quantificação, selecione a guia de análise ao longo da parte superior da página e selecione desenhar retângulo para desenhar um retângulo sobre a área que será quantificada.
Para visualizar o tamanho do retângulo, selecione formas ao longo da parte inferior esquerda da tela. Em seguida, selecione colunas ao longo da parte inferior direita. Em seguida, adicione colunas de altura e largura para identificar o tamanho da forma.
Por fim, nomeie a forma e repita. Uma vez que todas as regiões sejam amostradas, proceda à combinação e análise dos dados disponíveis na guia colunas. Para verificar se esse protocolo funciona, as seções cerebrais foram incubadas com anticorpos primários e secundários, apenas anticorpos secundários, ou nem anticorpos primários nem secundários.
A expressão c-jun do gene c-jun foi detectada no hipocampo dorsal e amígdala somente quando ambos os anticorpos primários e secundários foram aplicados no tecido cerebral. A sub-unidade GluR1 do receptor AMPA e a sub-unidade NR2A do receptor NMDA foram avaliadas na detecção de proteínas de fezes nos núcleos de amígdala. Isso permitiu examinar a proporção de receptores AMPA NMDA em subnucleos da amígdala que é uma assinatura neurobiológica de aprendizagem e memória.
Medidas médias e normalizadas de expressão proteica foram obtidas a partir de escaneamentos de alta resolução no hipocampo ventral. Utilizando o software de análise de imagem, um retângulo é colocado na região de interesse e a intensidade média da luz da forma foi usada como medida de expressão fluorófora, que é uma medida de expressão proteica. Para obter a curva normalizada, foi colocada uma forma em uma região que expressa alto sinal e baixo sinal na área sob a curva foi utilizado como medida de expressão proteica.
A maior luta com este procedimento é encontrar um anticorpo e garantir que ele funcione. A aplicação é simples. Meu conselho seria primeiro tentar um procedimento imunohistoquímico regular, depois tentar essa técnica.
Sempre realizando um ensaio de validação primeiro. A coisa mais importante a se lembrar é verificar a diluição do anticorpo e certificar-se de que ele é aplicado corretamente. Sem essas etapas, o procedimento falhará.
