Este protocolo es significativo porque permite cuantificar dos proteínas en la misma región cerebral. Esto permite al experimentador examinar la actividad en las vías de señalización molecular en las regiones cerebrales mediante el ensayo de pan y fosfoproteínas. También se puede utilizar para ensayar proteínas que son marcadores de diferentes fenómenos cognitivos.
Estamos utilizando una técnica relativamente simple, como la inmunohistoquímica, para responder preguntas que normalmente requieren técnicas más involucradas. Incluyendo el examen de la actividad de las vías de señalización molecular, examinar la relación AMPA/NMDA. Usando un criostato mantenido entre menos 9 grados Celsius y menos 12 grados Celsius, corte el cerebro de rata previamente aislado y congelado en regiones de interés a 30-50 micrómetros.
Montar directamente las rodajas en los portaobjetos de vidrio y almacenar a menos 80 grados Celsius hasta la inmunocitoquímica. Retire los portaobjetos de vidrio del congelador y dérelos equilibrar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Trabajando bajo una campana de humo, coloque los portaobjetos en 4%paraformaldehído en 0.1 MOLar PBS durante una a dos horas a temperatura ambiente para la fijación del tejido.
A continuación, enjuague los portaobjetos en 0,1 TBS molar tres veces durante 10 minutos cada uno. Para permeabilizar las membranas celulares, incubar los portaobjetos en un detergente suave durante 30-60 minutos. Y enjuague de nuevo en TBS tres veces durante 15 minutos cada uno.
Diluir el anticuerpo primario para proteínas de interés en PBS en la concentración correcta como se describe en el manuscrito. Pipeta solución de anticuerpos primarios directamente sobre el tejido cerebral. Coloque los resbalones de la cubierta en los portaobjetos e incubar el tejido cerebral en la dilución primaria de anticuerpos durante 1-2 horas a temperatura ambiente.
Después de la incubación, retire los resbalones de la cubierta y lave los portaobjetos en TBS que tenga una pequeña cantidad de detergente añadido, cuatro veces durante 15 minutos cada uno. Diluir el anticuerpo secundario en un diluyente que contenga TBS, detergente y 1,5% de suero huésped. Añadir anticuerpo secundario a los portaobjetos, cubrir con resbalones de cubierta e incubar a temperatura ambiente durante dos horas.
Después de la incubación, enjuague los portaobjetos en TBS-T cuatro veces durante 20 minutos cada uno y luego en TBS cuatro veces durante 20 minutos cada uno. Seque los portaobjetos a temperatura ambiente en la oscuridad, durante la noche. Coloque las diapositivas en la interfaz de escaneo casi infrarrojo con el tejido mirando hacia abajo.
Imagine varias diapositivas a la vez con la herramienta de selección. I imagen de las diapositivas utilizando el ajuste de la más alta calidad con una resolución de 21 micrómetros. En un desplazamiento de cero nanómetros, importe imágenes en un software de análisis de imágenes para ver y marcar el análisis de proteínas semicuaritativas.
Después de abrir el software de análisis de imágenes, seleccione el área de trabajo en la que se escaneó la imagen. A continuación, abra la imagen escaneada en el software de análisis de imágenes para ver el escaneo y ajustar las longitudes de onda, el contraste, el brillo y la ampliación que se muestran sin alterar la imagen en bruto ni la emisión cuantificada total. Después de identificar las regiones clave para la cuantificación, seleccione la pestaña de análisis a lo largo de la parte superior de la página y, a continuación, seleccione dibujar rectángulo para dibujar un rectángulo sobre el área que se cuantificará.
Para ver el tamaño del rectángulo, seleccione formas a lo largo de la parte inferior izquierda de la pantalla. A continuación, seleccione columnas a lo largo de la parte inferior derecha. A continuación, agregue columnas de alto y ancho para identificar el tamaño de la forma.
Por último, asigne un nombre a la forma y repita. Una vez muestreadas todas las regiones, continúe con la combinación y el análisis de los datos disponibles en la pestaña de columnas. Para verificar que este protocolo funciona, las secciones cerebrales se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios, anticuerpos secundarios solos o ni anticuerpos primarios ni secundarios.
La expresión inmediata temprana del gen c-jun se detectó en el hipocampo dorsal y la amígdala sólo cuando se aplicaron anticuerpos primarios y secundarios al tejido cerebral. La subunidad GluR1 del receptor AMPA y la subunidad NR2A del receptor NMDA se formaron en la detección de proteínas de heces en núcleos de amígdala. Esto permitió examinar la relación de receptores NMDA AMPA en subnúclees de la amígdala que es una firma neurobiológica de aprendizaje y memoria.
Las medidas medias y normalizadas de la expresión proteica se obtuvieron a partir de exploraciones de alta resolución en el hipocampo ventral. Usando el software de análisis de imágenes, se coloca un rectángulo en la región de interés y la intensidad media de la luz de la forma se utilizó como una medida de la expresión de fluoróforo, que es una medida de la expresión de proteínas. Para obtener la curva normalizada, se colocó una forma a través de una región que expresa señal alta y señal baja en el área debajo de la curva se utilizó como medida de expresión de proteínas.
La mayor dificultad con este procedimiento es encontrar un anticuerpo y asegurarse de que funciona. La aplicación es simple. Mi consejo sería primero intentar un procedimiento inmunohistoquímico regular, luego probar esta técnica.
Siempre realizando primero un ensayo de validación. Lo más importante a recordar es comprobar la dilución de los anticuerpos y asegurarse de que se aplica correctamente. Sin estos pasos, se producirá un error en el procedimiento.
